戊糖乳桿菌產(chǎn)γ-氨基丁酸及其乳制品的研究.pdf

1、γ-氨基丁酸(GABA)是一種非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸，有很好的降低血壓，鎮(zhèn)靜安神，抗焦慮，促進精子受精，改善肝腎功能等生理功能。GABA是由谷氨酸脫羧酶(GAD)催化L-谷氨酸(L-Glu)并脫羧合成而來。部分乳酸菌菌株具有轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生成GABA的能力。本文篩選獲得了2株高產(chǎn)GABA的乳桿菌菌株(P和Ind-3)，基于細胞形態(tài)、菌株的生理生化特征以及16S rRNA測序數(shù)據(jù)證實這2株乳桿菌為戊糖乳桿菌，在此基礎(chǔ)上，從產(chǎn)GABA戊糖

2、乳桿菌代謝L-Glu生成GABA的條件、谷氨酸脫羧酶(GAD)的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)以及產(chǎn)GABA菌株在發(fā)酵乳中的應(yīng)用等方面進行研究，旨在利用高產(chǎn)GABA乳酸菌菌株來提高乳制品中的GABA含量，以此提高乳制品的功能性。主要結(jié)果如下: 1、建立了γ-氨基丁酸(GABA)的液相色譜、改良紙層析法和Berthelot比色法三種檢測方法的定性和定量分析程序。 ①液相色譜條件是:采用鄰苯二甲醛為衍生試劑，色譜柱為反相C18柱(250

3、mm×4.6mm,5μm)；流動相:0.1mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH=6.0):四氫呋喃:甲醇=52:2:46；檢測條件:紫外338nm。 ②改良紙層析條件是:展開劑配方為:正丁醇:冰乙酸:水=4:2:1(含0.4g/L茚三酮);30℃展開3.5h，風(fēng)干后90℃烘干10min，將對應(yīng)斑點剪下用洗脫液(V75％乙醇:V0.1％硫酸銅=38:2)，洗脫25min后在510nm測定其吸光度值。 ③Berthelot比色法

4、條件是:取0.6mL酶反應(yīng)液加入0.4mL，硼酸緩沖溶液中止反應(yīng)，再加入0.8mL6％苯酚溶液和1.6mL次氯酸鈉溶液(含有效氯5.25％)，沸水浴10min后迅速冰浴20min，在630nm測吸光度值。 2、篩選得到兩株具有較高產(chǎn)生GABA的乳桿菌菌株，基于細胞形態(tài)、生理生化特性和16s rRNA測試數(shù)據(jù)，2株乳桿菌被鑒定為戊糖乳桿菌，即Lactobacillus pentosusP和Lactobacillus pentosu

5、s Ind-3。在MRS培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)48h，2株菌的GABA產(chǎn)量分別是0.3615g/L和0.1575 g/L。 3、戊糖乳桿菌菌株P(guān)和Ind-3轉(zhuǎn)化L-Glu合成GABA的優(yōu)化條件是:最適發(fā)酵溫度為37℃，pH 7.0，葡萄糖(20g/L)為碳源，胰蛋白胨、酵母膏及牛肉膏(均10g/L)為復(fù)合氮源，L-谷氨酸單鈉(MSG)添加量15g/L，CaCl2濃度為0.5mmol/L，接種量2％(V/V，菌數(shù)108cfu/mL)

6、，種子的菌齡12h。在此優(yōu)化條件下，當菌株P(guān)厭氧培養(yǎng)至72h時，GABA的產(chǎn)量為1.0020g/L，而菌株Ind-3厭氧培養(yǎng)至84h，GABA的產(chǎn)量為0.3262g/L。將2株戊糖乳桿菌轉(zhuǎn)至4℃貯存時，其改良MRS培養(yǎng)液中的GABA濃度繼續(xù)上升，最高分別達到1.4064g/L和0.4563g/L。 4、戊糖乳桿菌菌株P(guān)和Ind-3的谷氨酸脫羧酶的相對分子質(zhì)量為43 KD；酶的最佳反應(yīng)時間是1h；最佳反應(yīng)溫度為37℃。研究表明，戊

7、糖乳桿菌的谷氨酸脫羧酶耐熱性差，當溫度超過60℃時，酶活力損失較快；酶的最適pH為4.8。研究了不同的金屬離子(1mmol/L)對酶活的影響，其中Ca2+對谷氨酸脫羧酶活力有較大促進作用，菌株P(guān)和Ind-3的GAD酶活性分別提高了126％和223％，Cu2+、Mn2+和Mg2+對谷氨酸脫羧酶活力促進作用次之，菌株P(guān)的GAD酶活分別提高了63％，109％和47％；Ind-3的GAD酶活分別提高了60％，12％和50％。K+和Fe2+對谷氨

8、酸脫羧酶活性起抑制作用，P的GAD酶活分別下降到59％和53％；Ind-3的GAD酶活分別下降到70％和63％。 5、接種產(chǎn)GABA的戊糖乳桿菌菌株到脫脂乳中，37℃厭氧培養(yǎng)24h表明，外源添加MSG可以誘導(dǎo)發(fā)酵乳中的GABA生成；添加碳源對生成GABA的影響順序是葡萄糖>蔗糖>乳糖，添加氮源對生成GABA的影響順序是酵母膏>蛋白胨>牛肉膏；MSG的添加量為2g/L。在上述條件下，與不添加MSG的發(fā)酵酸乳相比，接種戊糖乳桿菌菌株