乳酸菌細菌素分離純化及生物學特性研究.pdf

1、乳酸菌是一種在食品發(fā)酵工業(yè)中廣泛應用的益生菌。它可以抑制或殺死一些病原菌和食物腐敗菌，有利于人的健康。近幾年的研究表明有些乳酸菌均能分泌產(chǎn)生一種或多種抑菌物質(zhì)，其中由核糖體合成的一類稱為細菌素的具有抑菌活性的多肽或前體多肽，因其具有高效、無毒、無殘留、無抗藥性等優(yōu)點已成為生物食品防腐研究的重點，同時被認為是抗生素最有效的替代物。 自乳酸乳球菌產(chǎn)生的細菌素nisin獲準作為安全性高的食品防腐劑以來，細菌素的研究已成為微生物學研究中

2、一個活躍的領(lǐng)域。研究內(nèi)容主要涉及產(chǎn)細菌素菌株的篩選和鑒定、細菌素的分離純化、理化性質(zhì)、作用機制、發(fā)酵條件和應用以及工程菌株的構(gòu)建等。近年來關(guān)于細菌素的研究雖在分子水平和應用研究上取得很大進展，但分離純化效率仍不甚理想。因此，本實驗旨在篩選出一種產(chǎn)廣譜細菌素的乳酸菌，著重研究該細菌素的分離純化方法，進而對其進行鑒定和特性分析。 1、采用雙層瓊脂牛津杯法，以藤黃微球菌為指示菌，對13種菌株(經(jīng)本實驗室篩選保存)進行篩選。同時分別排除

3、了三個干擾因素——酸性末端產(chǎn)物、過氧化氫以及離心上清液菌體殘留細胞；并采用蛋白酶作最后的產(chǎn)細菌素鑒定。實驗結(jié)果顯示，有五種乳酸菌產(chǎn)細菌素，其中8號從嬰兒糞便中篩選分離得到的菌株穩(wěn)定性最好，抑菌活性最強。經(jīng)。PCR分子鑒定和理化性質(zhì)的研究得出該菌株為植物乳桿菌Lplantarum DSM20205；理化性質(zhì)基本符合乳桿菌的特征，淀粉水解、油脂水解、明膠水解和尿素試驗、吲哚試驗、M．R試驗、V．P試驗、硫化氫試驗反應均呈陰性，糖發(fā)酵試驗則大

4、多數(shù)呈陽性反應。據(jù)所查文獻涉及的范圍，目前為止該細菌素的發(fā)現(xiàn)應屬首例，國內(nèi)外還沒有分離純化過該植物乳桿菌．L．plantarum DSM20205分泌產(chǎn)生的細菌素，因此本論文將該細菌素命名為plantaricin DSM20205。 2、采用雙層瓊脂牛津杯法對細菌素plantaricin：DSM20205進行抑菌譜測定。結(jié)果顯示該細菌素對16個指示菌中的10個菌株有抑制作用，其中大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌均屬

5、革蘭氏陰性菌。對發(fā)酵乳桿菌、乳酸乳球菌、醋酸菌、釀酒酵母均無抑制作用。大部分細菌素只對革蘭氏陽性菌有抑菌作用，只有少數(shù)細菌素對部分革蘭氏陰性菌有抑制作用。本實驗發(fā)現(xiàn)的該植物乳桿菌素不僅對革蘭氏陽性菌有抑制作用，而且對很多革蘭氏陰性菌也有抑制作用，具有廣譜的抗菌性。 3、該植物乳桿菌素的生化特性研究主要包括對溫度的穩(wěn)定性、對pH的耐受性以及對酶的敏感性。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)該細菌素具有以下特點：(1)具有良好的熱穩(wěn)定性，即使在121℃下處

6、理30min仍具有較好的抑菌活性；(2)只有在酸性條件(pH<4)下，才具有抑菌活性；(3)對胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K以及溶菌酶均敏感，但對過氧化氫酶敏感性較弱。 4、對該細菌素進行分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定。(1)經(jīng)過實驗比對，最終確定的分離路線為：硫酸銨梯度沉淀，由飽和度45％升至60％，收集沉淀，水溶，超濾濃縮，Tricine-SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示此活性蛋白的分子量約為2-3kDa；純化路線為：超濾濃縮后的樣品采