植物乳桿菌ZJ316細(xì)菌素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆和表達(dá)研究.pdf

1、三磷酸腺苷結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATPbindingcassette，ABC)是目前發(fā)現(xiàn)的最大的膜蛋白家族之一，廣泛分布于從細(xì)菌到人類等各種生物體中，每個(gè)成員都含有兩個(gè)高度保守的ATP結(jié)合區(qū)(ATPbindingcassette)，可通過結(jié)合ATP發(fā)生二聚化水解釋放能量，并形成一個(gè)跨膜通道從而實(shí)現(xiàn)多種底物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)?？赊D(zhuǎn)運(yùn)的底物包括:無機(jī)離子、無機(jī)酸、氨基酸、脂類、糖類、多肽、各類藥物、細(xì)胞代謝產(chǎn)物等。有的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白專一性很高，只能轉(zhuǎn)運(yùn)

2、特定的物質(zhì);有的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)完全不同的物質(zhì)。本文從克隆植物乳桿菌ZJ316的細(xì)菌素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因出發(fā)，對其編碼的蛋白PlnH進(jìn)行了生物信息學(xué)研究，在外源表達(dá)菌株中得到了表達(dá)后并對其產(chǎn)生誘導(dǎo)蛋白的條件進(jìn)行了優(yōu)化，初步純化出了目的蛋白。這就不僅使得植物乳桿菌的細(xì)菌素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白豐富了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究提供了更深入的研究材料;也為以后的科學(xué)研究和微生物的利用提供了新的思路。
　　 本研究從實(shí)驗(yàn)室分離保存的

3、一株高效產(chǎn)細(xì)菌素的植物乳桿菌ZJ316(LactobacillusplantarumZJ316)出發(fā)，采用改良后的CTAB法提取其總基因組，通過NCBI數(shù)據(jù)庫和軟件PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)釣取細(xì)菌素ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的引物，并在適合的條件和反應(yīng)體系中克隆出ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。結(jié)果顯示該基因序列共由1377bp組成，與NCBI數(shù)據(jù)庫上公布的plnH基因同源性為99％，蛋白的氨基酸殘基數(shù)為458個(gè);分子質(zhì)量約為50.0kDa，理論

4、等電點(diǎn)pI=9.44，屬于穩(wěn)定性蛋白;二級結(jié)構(gòu)約有51.97％的α-螺旋，11.14％的β-折疊，36.90％的無規(guī)則卷曲;PlnH蛋白在前100個(gè)氨基酸存在著較強(qiáng)的疏水性，其后的部分親疏水性交替排列著;從第19個(gè)AA到第41個(gè)氨基酸存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，具有兩個(gè)低復(fù)雜度序列，一個(gè)卷曲螺旋區(qū)域，可能存在信號肽;存在5個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、9個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、11個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、3

5、個(gè)N-肉豆蔻位點(diǎn)。
　　 為了以后能夠在體外研究該蛋白的結(jié)構(gòu)特征等，實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-plnH，并根據(jù)pET28a多克隆位點(diǎn)特征設(shè)計(jì)了BamH(Ⅰ)和Xho(Ⅰ)兩高效酶切位點(diǎn)。通過菌落PCR、質(zhì)粒單雙酶切、基因測序驗(yàn)證了重組質(zhì)粒的正確性。利用SDS-PAGE電泳驗(yàn)證了細(xì)菌素ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PlnH在18℃過夜誘導(dǎo)條件下有所表達(dá)后，對其誘導(dǎo)表達(dá)體系進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明:當(dāng)誘導(dǎo)溫度為30℃、IPTG濃度為1.0mm