瑞氏木霉T-DNA插入篩選纖維素降解突變株及液泡蛋白分選受體基因功能研究.pdf

1、瑞氏木霉(Trichoderma reesei)是一種能夠降解纖維素、半纖維素等復(fù)雜基質(zhì)的具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的工業(yè)絲狀真菌,長(zhǎng)期以來(lái)用于生產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶和蛋白酶等多種酶類(lèi)。同時(shí),瑞氏木霉具有良好的分泌胞外蛋白(酶類(lèi))的能力和真核生物蛋白修飾加工機(jī)制,也成為異源蛋白表達(dá)的良好宿主。目前,在纖維素乙醇生產(chǎn)的過(guò)程中,纖維素酶活力和產(chǎn)量是制約纖維素乙醇生產(chǎn)的主要瓶頸,篩選纖維素酶高產(chǎn)菌株一直備受重視。同時(shí),在纖維素酶分泌過(guò)程中的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)途

2、徑是控制大量纖維素酶成功輸出的重要環(huán)節(jié)。因此,建立有效的分子突變技術(shù)將有助于快速篩選高產(chǎn)纖維素酶的突變菌株,而研究蛋白分泌途徑的特定靶標(biāo)基因功能將有助于鑒定纖維素酶運(yùn)輸分泌過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控因子。
　　 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入突變技術(shù)具有轉(zhuǎn)化效率高、遺傳穩(wěn)定性好、隨機(jī)單拷貝插入等特點(diǎn),一次轉(zhuǎn)化可獲得大量轉(zhuǎn)化子,是進(jìn)行大規(guī)模突變菌株篩選的有力方法。而最近發(fā)展起來(lái)的絲狀真菌基因打靶技術(shù)在基因功能研究及菌株遺傳改造方面,發(fā)揮著越來(lái)越重

3、要的作用。因此,建立方便高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瑞氏木霉T-DNA插入突變系統(tǒng),獲得瑞氏木霉的突變體庫(kù),可快速篩選纖維素降解能力提高的菌株。而利用基因打靶技術(shù)研究蛋白分泌途徑的重要基因的功能有利于了解纖維素酶分泌輸出的機(jī)制。本文采用新型抗生素為標(biāo)記著眼建立高效率的瑞氏木霉T-DNA插入突變體庫(kù)篩選纖維素降解突變菌株,并利用基因打靶技術(shù)研究蛋白分泌途徑中的液泡蛋白分選受體vps10基因試圖了解纖維素酶在分泌過(guò)程中的運(yùn)輸機(jī)制。
　　 本文

4、以抗硫胺素(ptrA)為標(biāo)記,利用農(nóng)桿菌EHA105成功介導(dǎo)轉(zhuǎn)化了瑞氏木霉纖維素酶高產(chǎn)菌株Rut-C30。首先,將來(lái)自于質(zhì)粒T-ptrA的抗硫胺素(ptrA)表達(dá)盒插入到Ti質(zhì)粒pCAMBIA0390中,構(gòu)建了雙元載體pCTA。然后,將該雙元載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105后,與瑞氏木霉孢子共培養(yǎng),在含抗硫胺素平板上篩選抗性轉(zhuǎn)化子。通過(guò)PCR驗(yàn)證,表明T-DNA上的ptrA基因已插入到瑞氏木霉轉(zhuǎn)化子染色體中。利用纖維素平板初步篩選轉(zhuǎn)化子,得到

5、纖維素降解能力變化的菌株30余株;然后,進(jìn)一步利用液體發(fā)酵進(jìn)行纖維素酶活力測(cè)定,得到纖維素酶活分別有不同程度提高的轉(zhuǎn)化子2株和酶活力高峰提前的菌株1株。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入突變技術(shù)可用于大規(guī)模篩選獲得具有不同性狀的突變菌株,該技術(shù)也是篩選瑞氏木霉纖維素降解突變菌株,深入了解瑞氏木霉纖維素酶合成和分泌機(jī)制的有效方法。
　　 為研究瑞氏木霉液泡蛋白分選受體vps10基因的功能,本文從瑞氏木霉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Bla

6、st查找到vps10基因序列,然后根據(jù)DNA序列設(shè)計(jì)引物,構(gòu)建了vps10基因敲除盒Pvps10-ptrA-Tvps10。利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法構(gòu)建了瑞氏木霉vps10基因缺失菌株QM-△VPS10,并對(duì)缺失菌株進(jìn)行了生長(zhǎng)和產(chǎn)酶分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,基因缺失菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)與野生型菌株基本一致,生物量略有提高,對(duì)纖維素酶的分泌影響不顯著,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示vps10基因敲除對(duì)瑞氏木霉野生型菌株QM9414的蛋白分泌沒(méi)有顯著影響,但據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道該基因敲除

7、有可能對(duì)具有高表達(dá)外源蛋白的基因工程菌株有作用。
　　 另外,本文以瑞氏木霉△tku70菌株為出發(fā)菌株,構(gòu)建了木聚糖酶Ⅰ缺失菌株△XYN1,研究了木聚糖酶Ⅰ缺失對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:木聚糖酶Ⅰ缺失突變株木聚糖酶活力顯著降低,胞外蛋白總量也有所降低。對(duì)其纖維素酶活力進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn),其FPA活力在培養(yǎng)過(guò)程中有所降低,尤其是其pNPG和pNPC酶活力顯著下降。該菌株的構(gòu)建有利于闡明半纖維素酶和纖維素酶基因表達(dá)之間的相互影