里氏木霉纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄因子及輔調(diào)控因子的篩選鑒定及功能分析.pdf

1、木質(zhì)纖維素是地球上含量最為豐富的碳水化合物之一，絲狀真菌是自然界中降解木質(zhì)纖維素的主要微生物類別，而里氏木霉（Trichoderma reesei）是其中的典型代表。在纖維素等底物存在的條件下，里氏木霉能表達(dá)分泌大量的纖維素酶以實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素的高效降解，因此成為纖維素酶工業(yè)的主要生產(chǎn)菌株。
　　目前對(duì)里氏木霉纖維素酶表達(dá)合成的研究主要集中在兩個(gè)方面:一方面集中在纖維素酶基因的表達(dá)調(diào)控方面，以期從理論上闡釋產(chǎn)酶調(diào)控機(jī)制，從而為通過菌株

2、的遺傳改造提升纖維素酶的表達(dá)水平提供理論支持;另一方面，通過對(duì)里氏木霉現(xiàn)有酶系組分的性能改善或合理復(fù)配以提高其酶解效率。在纖維素酶基因表達(dá)調(diào)控方面，目前已經(jīng)鑒定到了多個(gè)直接參與酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子包括正調(diào)控因子及負(fù)調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn)，不同的轉(zhuǎn)錄因子在啟動(dòng)子上具有各自特定的結(jié)合位點(diǎn)及生物學(xué)功能，這意味著纖維素酶基因的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄是一個(gè)多轉(zhuǎn)錄因子參與，從而響應(yīng)不同環(huán)境信號(hào)的復(fù)雜過程。為了更為深入地了解這一復(fù)雜過程，有必要篩選鑒定纖維素酶基因表達(dá)

3、過程中涉及的其他未知轉(zhuǎn)錄因子及輔功能因子，從而解析里氏木霉纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　此外，作為真菌的里氏木霉，其染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化包括重構(gòu)和核小體共價(jià)修飾可能也是纖維素酶基因誘導(dǎo)表達(dá)過程中的重要影響因素，系統(tǒng)闡述此種變化在里氏木霉纖維素酶基因表達(dá)過程中的作用對(duì)全面理解相關(guān)調(diào)控機(jī)制也極為重要。因此，論文工作主要從上述幾個(gè)方面展開，取得相應(yīng)結(jié)果如下:
　　一、鑒定了一個(gè)新的纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄抑制因子Rce1，其通過與Xyr1

4、在纖維素酶基因啟動(dòng)子上競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合參與纖維素酶基因的表達(dá)調(diào)控
　　以里氏木霉主要的纖維素酶基因啟動(dòng)子(Pcbh1)為“誘餌”，從里氏木霉cDNA文庫中篩選獲得了真菌典型轉(zhuǎn)錄因子Ga14類型的轉(zhuǎn)錄因子Rce1。細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)Rce1主要位于細(xì)胞核。對(duì)rce1的缺失及過表達(dá)分析表明，Rce1在纖維素酶表達(dá)過程中發(fā)揮抑制作用。通過體外的凝膠泳動(dòng)遷移(EMSA)及DNA足跡保護(hù)(DNAse Ifootprinting)實(shí)驗(yàn)鑒定了Rce1在

5、cbh1啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其與纖維素酶基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活因子Xyr1具有相似的結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步通過體外競(jìng)爭(zhēng)及染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，Rce1在纖維素誘導(dǎo)表達(dá)過程中與Xyr1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合纖維素酶基因啟動(dòng)子，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素酶表達(dá)的抑制作用，而xyr1過表達(dá)可以解除rce1對(duì)纖維素酶的表達(dá)抑制。綜上所述，我們通過酵母單雜交篩選到一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子Rce1，通過與轉(zhuǎn)錄激活因子Xyr1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合纖維素酶基因啟動(dòng)子來調(diào)控纖維素

6、酶的表達(dá)。
　　二、發(fā)現(xiàn)泛素結(jié)合酶TrUbc4在里氏木霉纖維素酶表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用
　　以纖維素酶基因啟動(dòng)子cbh1為“誘餌”，從里氏木霉cDNA文庫中還篩選獲得了一個(gè)屬于UBC超家族的泛素結(jié)合酶TrUbc4。細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)TrUbc4定位于細(xì)胞核。TrUbc4編碼基因的敲除顯著降低了里氏木霉纖維素酶基因的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。突變體回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TrUbc4的活性位點(diǎn)C85在纖維素酶表達(dá)過程中發(fā)揮著重要作用。在Xyr1過表

7、達(dá)菌株中缺失Trubc4并分析表型發(fā)現(xiàn)，Xyr1的過表達(dá)并不能恢復(fù)Trubc4缺失對(duì)纖維素酶表達(dá)造成的的下調(diào)。進(jìn)一步的ChIP分析發(fā)現(xiàn)，Trubc4缺失導(dǎo)致Xyr1在纖維素酶基因啟動(dòng)子區(qū)的占據(jù)水平顯著降低，這種降低即使在Xyr1過表達(dá)的情況下仍然存在。以TrUbc4為“誘餌”進(jìn)行酵母雙雜交文庫篩選，獲得了具有SWIB/MDM結(jié)構(gòu)域的蛋白TrSnf12。該基因的缺失表型及蛋白細(xì)胞定位與TrUbc4類似，但是我們并沒有檢測(cè)到TrSnf12的

8、泛素連接酶活性。綜合上述結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)Trubc4在纖維素酶基因誘導(dǎo)表達(dá)過程中發(fā)揮著重要作用，此種作用是特異性的，并且依賴于其泛素結(jié)合酶活性。
　　三、泛素修飾組學(xué)初步分析TrUbc4可能參與里氏木霉多種生理調(diào)控過程
　　對(duì)TU6以及Trubc4缺失菌進(jìn)行了泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究，鑒定到位于1385個(gè)蛋白上的2563個(gè)泛素化位點(diǎn)，其中941個(gè)蛋白的1623個(gè)位點(diǎn)包含定量信息。以1.5倍為變化閾值，在具有定量信息的泛素化位點(diǎn)

9、中，△Trubc4/TU6比較組中有396個(gè)位點(diǎn)的修飾水平發(fā)生上調(diào)，298個(gè)位點(diǎn)的修飾水平發(fā)生下調(diào)，△Trubc4缺失導(dǎo)致里氏木霉整體的泛素化水平升高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)與TU6相比，有295個(gè)位點(diǎn)，258個(gè)蛋白在△Trubc4缺失菌中未檢測(cè)到，這些蛋白涉及了轉(zhuǎn)錄因子、泛素結(jié)合酶、蛋白激酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及SAGA復(fù)合物，這說明Trubc4可能參與里氏木霉多種調(diào)控過程。
　　四、Xyr1招募SWI/SNF復(fù)合物參與纖維素酶基因的表達(dá)調(diào)控<

10、br>　　酵母雙雜交及體外GST-pull down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所鑒定的里氏木霉?jié)撛诘腟WI/SNF復(fù)合物同源亞基TrSnf12與Xyr1的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain，AD)區(qū)存在相互作用，并且TrSnf12與同源核心亞基TrSwi1也存在相互作用。Trswi1及另一個(gè)同源核心亞基編碼基因Trsnf5的缺失對(duì)里氏木霉的生長及生孢均具有嚴(yán)重的影響，并且使得纖維素酶的表達(dá)性能喪失。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在纖維素誘導(dǎo)條件

11、下，TrSwi1及TrSnf5均能被招募至纖維素酶基因啟動(dòng)子區(qū)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在Xyr1過表達(dá)背景下，即使在非誘導(dǎo)條件下，TrSwi1也能被招募至纖維素酶基因啟動(dòng)子區(qū)，這說明Xyr1可能通過與TrSnf12之間的相互作用，通過靶向募集TrSwi1來介導(dǎo)纖維素酶基因啟動(dòng)子區(qū)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而調(diào)控纖維素酶基因的表達(dá)。然而，對(duì)OExyr1Δswi1/snf5的表型分析發(fā)現(xiàn)，在xyr1過表達(dá)的條件下，無論是誘導(dǎo)條件還是非誘導(dǎo)條件，Trsw