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文檔簡介
1、利用纖維素的最佳方法是微生物降解轉(zhuǎn)化,鑒于目前纖維素降解菌株酶活力低、纖維素酶誘導(dǎo)產(chǎn)酶及纖維素降解機(jī)理不完全清楚等限制纖維素資源有效利用的情況下,為了有效利用纖維素這種可再生能源,篩選高效降解菌,研究菌株產(chǎn)酶機(jī)制以及纖維素降解機(jī)理仍然具有重要的理論和實(shí)踐意義。
本文從57份土樣中,通過分離純化得到97株菌株。對其進(jìn)行剛果紅鑒別培養(yǎng)基和濾紙條液體培養(yǎng)法初篩,并結(jié)合復(fù)篩得到2株纖維素酶活較高的菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定H-11為簡青霉(P
2、enicillium simplicissimum),C-08為綠色木霉(Trichoderma viride)。
研究了幾種影響二菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的因素,液體發(fā)酵結(jié)果表明:麩皮和稻草為適合碳源,兩者比例H-11為4:3,C-08為5:2;最適有機(jī)氮源為豆餅粉,而無機(jī)氮源分別是KNO3和(NH4)2SO4。H-11產(chǎn)酶最適為豆餅粉,而C-08產(chǎn)酶的(NH4)2SO4:豆餅粉比例為1:5。最適產(chǎn)酶碳源和氮源比例,H-11為7:1,C
3、-08為5:1;最適百分含量,都為3.6%;最適產(chǎn)酶pH,H-11為3.6,C-08為3.2;最適溫度都為30℃;最適產(chǎn)酶時(shí)間H-11為144h,C-08為96h。
固態(tài)發(fā)酵結(jié)果表明:秸稈粉和麩皮為2∶4最適合產(chǎn)酶;尿素和氨態(tài)氮適合H-11產(chǎn)酶。氨態(tài)氮適合C-08產(chǎn)CMCase,NO3-利于產(chǎn)Xylanase,其中NH4NO3最好;料水比1∶1比較適合H-11產(chǎn)CMCase,1∶1.5適合產(chǎn)Xylanase。料水比1∶2適合C
4、-08產(chǎn)CMCase,1∶2.5適合產(chǎn)Xylanase;H-11隨底物粒度的降低CMCase增加,在60~100目時(shí)產(chǎn)Xylanase最低。稻草粉粒度40~100目時(shí),適合C-08產(chǎn)CMCase,此范圍外適合產(chǎn)Xylanase;初始pH為3和4時(shí)則適合H-11菌株產(chǎn)CMCase和Xylanase。pH值為4適合C-08產(chǎn)酶;孢子接種量為7~8×107孢子/mL時(shí)適合兩株菌產(chǎn)酶;28℃適合H-11產(chǎn)酶,在低于28℃時(shí)適合C-08產(chǎn)酶;發(fā)酵
5、時(shí)間H-11為60h,C-08為72h。
固定化研究表明,制備小球的最適海藻酸鈉溶液濃度為5%。麩皮汁較適合菌株產(chǎn)酶,H-11比C-08產(chǎn)酶能力強(qiáng)。菌株間親和性不強(qiáng)。H-11則在pH為3和4時(shí),更適合產(chǎn)CMCase和Xylanase,C-08產(chǎn)酶適宜pH為7。固定化細(xì)胞產(chǎn)酶能力強(qiáng)于游離細(xì)胞。Tween-80有利于提高菌株的產(chǎn)酶活力。
利用液體培養(yǎng)和洗滌菌絲誘導(dǎo)培養(yǎng)法研究了碳源對菌株的誘導(dǎo)特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)D-甘露糖對H-
6、11有較好的誘導(dǎo)作用,葡萄糖對C-08有較好的產(chǎn)酶作用。葡萄糖促使H-11、C-08產(chǎn)生FPase、CMCase、C1和β-Gase,各種酶產(chǎn)量在菌株間及菌株內(nèi)差別很大。
制備細(xì)胞外、細(xì)胞壁膜、細(xì)胞內(nèi)纖維素酶,并用其分別轉(zhuǎn)化纖維二糖,對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高效液相色譜定性分析,從而探討碳源的誘導(dǎo)本質(zhì)。結(jié)果顯示:H-11胞內(nèi)酶和C-08的胞外酶的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物,除產(chǎn)生葡萄糖外,亦產(chǎn)生一種未知的物質(zhì)A。胞壁膜酶無轉(zhuǎn)化作用。H-11的胞外酶和C-08
7、的胞內(nèi)酶液對纖維二糖除水解外亦有轉(zhuǎn)化作用。從而證明纖維二糖不是菌株的誘導(dǎo)物。
將H-11液體發(fā)酵粗酶液經(jīng)硫酸銨分級沉淀、柱層析后得到電泳純的β-GaseⅠ、β-GaseⅡ和CMCase組分。對純組分的理化性質(zhì)研究表明:三組分的分子量分別為126.0KDa、77.8KDa和33.2kDa;最適溫度都為60℃,分別在40℃、40℃和50℃以下穩(wěn)定;最適pH值為pH4.4~5.2、3.6~4.0和2.8,在pH值4.4~6.8、2.
8、8~6.8和2.8~6.8范圍內(nèi)穩(wěn)定。Mn2+、Ca2+、Sn2+和Li+對β-GaseⅠ有促進(jìn)作用,Mg2+、Zn2+、Cu2+、Co2+、Fe2+和Fe3+對β-GaseⅠ有抑制作用;Mn2+、Sn2+和Fe2+對β-GaseⅡ有促進(jìn)作用,Zn2+、Cu2+、Co2+和Fe3+對β-GaseⅡ有抑制作用;Sn2+對CMCase酶活力有明顯的增強(qiáng)作用,Mn2+和Cu2+對酶有顯著的抑制作用。β-GaseⅠ水解水楊素的Km和Vmax值分
9、別622.306mg·mL-1和15.480mg·mL-1·min-1,β-GaseⅡ水解水楊素的Km和Vmax值分別26.689mg·mL-1和0.508mg·mL-1·min-1,CMCase作用于CMC-Na的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax值分別1.744mg·mL-1和14.124mg·mL-1·min-1。三種酶的底物特異性較差,β-GaseⅠ、β-GaseⅡ不以CMC-Na為底物,CMCase不作用于水楊素,除此之外,三組分對MC
10、C、濾紙、幾丁質(zhì)、pNPC和pNPG都有作用。
通過對三組分的紅外圖譜特征頻率區(qū)進(jìn)行分析,結(jié)果表明其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)都主要以α-螺旋形式存在。
H-11的粗酶液中C1、CMCase對MCC都具有吸附-解吸附作用,而β-Gase對MCC不具有吸附-解吸附作用,三種純組分和C-08粗酶液中的C1、CMCase、β-Gase對MCC都具有吸附-解吸附作用。
β-GaseⅠ和β-GaseⅡ?qū)MCase降解纖維素有很
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