降解纖維素菌種篩選及纖維素降解研究.pdf

1、利用纖維素的最佳方法是微生物降解轉(zhuǎn)化，鑒于目前纖維素降解菌株酶活力低、纖維素酶誘導(dǎo)產(chǎn)酶及纖維素降解機(jī)理不完全清楚等限制纖維素資源有效利用的情況下，為了有效利用纖維素這種可再生能源，篩選高效降解菌，研究菌株產(chǎn)酶機(jī)制以及纖維素降解機(jī)理仍然具有重要的理論和實(shí)踐意義。
　　本文從57份土樣中，通過分離純化得到97株菌株。對其進(jìn)行剛果紅鑒別培養(yǎng)基和濾紙條液體培養(yǎng)法初篩，并結(jié)合復(fù)篩得到2株纖維素酶活較高的菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定H-11為簡青霉（P

2、enicillium simplicissimum），C-08為綠色木霉（Trichoderma viride）。
　　研究了幾種影響二菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的因素，液體發(fā)酵結(jié)果表明：麩皮和稻草為適合碳源，兩者比例H-11為4:3，C-08為5:2；最適有機(jī)氮源為豆餅粉，而無機(jī)氮源分別是KNO3和(NH4)2SO4。H-11產(chǎn)酶最適為豆餅粉，而C-08產(chǎn)酶的(NH4)2SO4:豆餅粉比例為1:5。最適產(chǎn)酶碳源和氮源比例，H-11為7:1，C

3、-08為5:1；最適百分含量，都為3.6％；最適產(chǎn)酶pH，H-11為3.6，C-08為3.2；最適溫度都為30℃；最適產(chǎn)酶時(shí)間H-11為144h，C-08為96h。
　　固態(tài)發(fā)酵結(jié)果表明：秸稈粉和麩皮為2∶4最適合產(chǎn)酶；尿素和氨態(tài)氮適合H-11產(chǎn)酶。氨態(tài)氮適合C-08產(chǎn)CMCase，NO3-利于產(chǎn)Xylanase，其中NH4NO3最好；料水比1∶1比較適合H-11產(chǎn)CMCase，1∶1.5適合產(chǎn)Xylanase。料水比1∶2適合C

4、-08產(chǎn)CMCase，1∶2.5適合產(chǎn)Xylanase；H-11隨底物粒度的降低CMCase增加，在60～100目時(shí)產(chǎn)Xylanase最低。稻草粉粒度40～100目時(shí)，適合C-08產(chǎn)CMCase，此范圍外適合產(chǎn)Xylanase；初始pH為3和4時(shí)則適合H-11菌株產(chǎn)CMCase和Xylanase。pH值為4適合C-08產(chǎn)酶；孢子接種量為7～8×107孢子/mL時(shí)適合兩株菌產(chǎn)酶；28℃適合H-11產(chǎn)酶，在低于28℃時(shí)適合C-08產(chǎn)酶；發(fā)酵

5、時(shí)間H-11為60h，C-08為72h。
　　固定化研究表明，制備小球的最適海藻酸鈉溶液濃度為5%。麩皮汁較適合菌株產(chǎn)酶，H-11比C-08產(chǎn)酶能力強(qiáng)。菌株間親和性不強(qiáng)。H-11則在pH為3和4時(shí)，更適合產(chǎn)CMCase和Xylanase，C-08產(chǎn)酶適宜pH為7。固定化細(xì)胞產(chǎn)酶能力強(qiáng)于游離細(xì)胞。Tween-80有利于提高菌株的產(chǎn)酶活力。
　　利用液體培養(yǎng)和洗滌菌絲誘導(dǎo)培養(yǎng)法研究了碳源對菌株的誘導(dǎo)特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)D-甘露糖對H-

6、11有較好的誘導(dǎo)作用，葡萄糖對C-08有較好的產(chǎn)酶作用。葡萄糖促使H-11、C-08產(chǎn)生FPase、CMCase、C1和β-Gase，各種酶產(chǎn)量在菌株間及菌株內(nèi)差別很大。
　　制備細(xì)胞外、細(xì)胞壁膜、細(xì)胞內(nèi)纖維素酶，并用其分別轉(zhuǎn)化纖維二糖，對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高效液相色譜定性分析，從而探討碳源的誘導(dǎo)本質(zhì)。結(jié)果顯示：H-11胞內(nèi)酶和C-08的胞外酶的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，除產(chǎn)生葡萄糖外，亦產(chǎn)生一種未知的物質(zhì)A。胞壁膜酶無轉(zhuǎn)化作用。H-11的胞外酶和C-08

7、的胞內(nèi)酶液對纖維二糖除水解外亦有轉(zhuǎn)化作用。從而證明纖維二糖不是菌株的誘導(dǎo)物。
　　將H-11液體發(fā)酵粗酶液經(jīng)硫酸銨分級沉淀、柱層析后得到電泳純的β-GaseⅠ、β-GaseⅡ和CMCase組分。對純組分的理化性質(zhì)研究表明：三組分的分子量分別為126.0KDa、77.8KDa和33.2kDa；最適溫度都為60℃，分別在40℃、40℃和50℃以下穩(wěn)定；最適pH值為pH4.4～5.2、3.6～4.0和2.8，在pH值4.4～6.8、2.

8、8～6.8和2.8～6.8范圍內(nèi)穩(wěn)定。Mn2+、Ca2+、Sn2+和Li+對β-GaseⅠ有促進(jìn)作用，Mg2+、Zn2+、Cu2+、Co2+、Fe2+和Fe3+對β-GaseⅠ有抑制作用；Mn2+、Sn2+和Fe2+對β-GaseⅡ有促進(jìn)作用，Zn2+、Cu2+、Co2+和Fe3+對β-GaseⅡ有抑制作用；Sn2+對CMCase酶活力有明顯的增強(qiáng)作用，Mn2+和Cu2+對酶有顯著的抑制作用。β-GaseⅠ水解水楊素的Km和Vmax值分

9、別622.306mg·mL-1和15.480mg·mL-1·min-1，β-GaseⅡ水解水楊素的Km和Vmax值分別26.689mg·mL-1和0.508mg·mL-1·min-1，CMCase作用于CMC-Na的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax值分別1.744mg·mL-1和14.124mg·mL-1·min-1。三種酶的底物特異性較差，β-GaseⅠ、β-GaseⅡ不以CMC-Na為底物，CMCase不作用于水楊素，除此之外，三組分對MC

10、C、濾紙、幾丁質(zhì)、pNPC和pNPG都有作用。
　　通過對三組分的紅外圖譜特征頻率區(qū)進(jìn)行分析，結(jié)果表明其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)都主要以α-螺旋形式存在。
　　H-11的粗酶液中C1、CMCase對MCC都具有吸附-解吸附作用，而β-Gase對MCC不具有吸附-解吸附作用，三種純組分和C-08粗酶液中的C1、CMCase、β-Gase對MCC都具有吸附-解吸附作用。
　　β-GaseⅠ和β-GaseⅡ?qū)MCase降解纖維素有很