瑞氏木霉纖維素酶在大腸桿菌中的重組表達(dá)研究.pdf

1、纖維素是地球上數(shù)量最多的可再生自然資源，從廉價(jià)的可再生的木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物能源及產(chǎn)品對(duì)維持人類社會(huì)的持續(xù)性發(fā)展至關(guān)重要。工業(yè)生產(chǎn)中將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖，進(jìn)一步發(fā)酵成為酒精是纖維素最有潛力的利用途徑之一。
　　 許多類型的真菌和細(xì)菌能夠產(chǎn)生水解纖維素的酶類，其中絲狀真菌瑞氏木霉（Trichoderma reesei）是最被廣泛研究的纖維素降解生物。T. Reesei 產(chǎn)生一系列不同的纖維素酶，其中大多數(shù)已經(jīng)被進(jìn)行了深入的研究。目前

2、已經(jīng)分離的T. Reesei纖維素酶基因至少包括兩種外切葡聚糖酶，Cel7A（CBH I)和 Cel6A（CBH II)，五種內(nèi)切葡聚糖酶，即Cel7B（EG I)、 Cel5A（EG II)、Cel12A（EG III)、Cel61A（EGIV)和 Cel45A（EG V)以及一種β-葡萄糖苷酶。
　　 為了研究纖維素酶的協(xié)同作用，需要獲得各種純的纖維素酶制劑。從微生物培養(yǎng)液中分離純化天然纖維素酶需要花費(fèi)大量時(shí)間和勞力，且常常

3、存在其它微量多糖水解酶的干擾影響。最好的辦法是利用基因工程菌異源表達(dá)重組纖維素酶。
　　 已知很多纖維素酶在真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如酵母細(xì)胞或絲狀真菌細(xì)胞中成功表達(dá)，但絲狀真菌細(xì)胞存在內(nèi)源纖維素酶干擾問題，酵母細(xì)胞也被發(fā)現(xiàn)存在內(nèi)源果膠酶，因而需要探討纖維素酶在原核細(xì)胞中異源重組表達(dá)。
　　 T. Reesei 葡聚糖內(nèi)切酶Cel5A 又稱EG II，占表達(dá)的纖維素酶總量的5-10％，是最重要的內(nèi)切酶之一，它具有很高的催化活性，

4、被廣泛用于紡織、印刷、染料、造紙和洗滌等工業(yè)。本文報(bào)道Cel5A 首次在大腸桿菌中異源重組表達(dá)及其重組酶酶學(xué)性質(zhì)的研究。通過RT-PCR的方法，獲得不含信號(hào)肽的瑞氏木霉葡聚糖內(nèi)切酶II（Cel5A）的cDNA，將其克隆到pET-28a(+)表達(dá)質(zhì)粒上，與其N 末端6個(gè)組氨酸標(biāo)簽序列融合，構(gòu)建成pET-28a(+)-egl2 表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)。利用低溫誘導(dǎo)策略，成功表達(dá)出活性重組蛋白，Western blot 結(jié)果顯示重組C

5、el5A 分子量大約為43 Kda。進(jìn)一步對(duì)重組Cel5A 進(jìn)行Ni-NTA 親和層析柱純化并對(duì)純化酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定，結(jié)果顯示，以CMC-Na 為作用底物時(shí)重組酶最適作用pH 為4.5，最適作用溫度為60 ℃；重組酶熱穩(wěn)定性較好，在65 ℃及以下保溫1.5h，活性仍相當(dāng)穩(wěn)定。Mn 2+對(duì)Cel5A的酶活有促進(jìn)作用，F(xiàn)e 3+和Cu 2+有抑制作用，其它金屬離子和EDTA 對(duì)酶活沒有明顯影響。底物特異性研究表明，重組Cel5A 只能水解

6、β-Glucan和CMC-Na，對(duì)β-Glucan的水解能力是其對(duì)CMC-Na 水解能力的6.7倍，但對(duì)微晶纖維素Avicel、Glass microfiber filters、Xylan、 Arabiroxylan和Xyloglucan 沒有水解作用。
　　 本文也進(jìn)行了Cel6A（瑞氏木霉外切葡聚糖酶II）在大腸桿菌中重組表達(dá)研究，結(jié)果顯示重組蛋白均以無活性的包涵體存在，沒有檢測(cè)到有活性蛋白的表達(dá)。
　　 由此可見蛋