人NGAL原核表達(dá)及多克隆抗體的制備.pdf

1、研究目的：
　　 人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(neutrophil gelatinase-associatedlipocalin，NGAL)是Kjeldsen等人于1993年在中性粒細(xì)胞的特殊顆粒中首先發(fā)現(xiàn)的。以往的研究表明NGAL與炎癥、胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答、趨化作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展等過程密切相關(guān)。NGAL在乳腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌、胃癌、慢性粒細(xì)胞性白血病等細(xì)胞系中均過表達(dá)，并在癌細(xì)胞的浸潤與不良分化

2、中發(fā)揮重要的作用。進(jìn)一步研究證實，NGAL是多種原因引起的腎損傷的一個保護(hù)因素并且由于分子量小，對蛋白酶有天然的抗性，NGAL在腎臟損傷后很快聚積，在尿液中出現(xiàn)早，可作為急性腎衰的診斷標(biāo)記物，是有效評價急性腎衰臨床治療效果及預(yù)后的良好指標(biāo)。本文構(gòu)建NGAL原核表達(dá)載體，并在原核細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)人NGAL的融合蛋白pET28a-NGAL，融合蛋白經(jīng)純化后作為抗原，免疫動物，制備多克隆抗體，為進(jìn)一步闡明NGAL生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
　　

3、 研究方法：
　　 1構(gòu)建NGAL原核表達(dá)載體
　　 用RT-PCR方法從K562細(xì)胞株總RNA中克隆NGAL的cDNA片段，以此片段為模板行PCR，再將擴(kuò)增片段與載體pET28a同時用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，回收后將目的片段連接入原核表達(dá)載體pET28a中，將NGAL原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Ecoli Rosetta DE3、篩選陽性菌落、提取質(zhì)粒后雙酶切、載體測序引物進(jìn)行測序。將測序結(jié)果和NGAL基因的ORF序列及p

4、ET28a載體多克隆位點進(jìn)行同源比較，檢測原核表達(dá)載體pET28a-NGAL克隆正確。
　　 2 pET28a-NGAL融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
　　 pET28a及表達(dá)載體pET28a-NGAL轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta DE3，菌落PCR、再小量提質(zhì)粒后，行雙酶切和測序鑒定正確后。再以最終濃度為1mM IPTG誘導(dǎo)目的蛋白在Rosetta DE3中表達(dá)，目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)3 h后，分別收集上清液和沉淀，再行SDS-PAGE電

5、泳，考馬斯亮藍(lán)染色后，凝膠成像分析電泳圖像，融合蛋白表達(dá)率由Quantity One分析所得。
　　 3 pET28a-NGAL多克隆抗體制備
　　 將大量擴(kuò)增的融合蛋白行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色鑒定有目的融合蛋白表達(dá)，再對照標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，切取同等條件下經(jīng)KCL染色含目的蛋白條帶的凝膠，PBS充分研磨、反復(fù)凍融后取上清，將其與同體積弗氏完全佐劑混合，多點注射入家兔背部皮下，每2周免疫一次，共計4次(

6、后三次加強(qiáng)免疫時選用弗氏不完全佐劑)。末次免疫后10天，選用頸動脈放血法提取抗血清，抗血清經(jīng)飽和硫酸銨法粗純后，再過羊抗兔IgG親和柱進(jìn)行精純，分裝后-20℃保存。
　　 4.抗體特異性檢測
　　 ELISA確定抗血清效價后，不同稀釋濃度確定該抗體的最適滴度，再利用自制多克隆抗體(1:1000稀釋)，進(jìn)行western blot實驗，檢測NGAL融合總蛋白和切膠純化蛋白的表達(dá)。以驗證自制多克隆抗體對NGAL抗原特異性的識

7、別。并以此抗體用于免疫組化實驗檢測乳腺癌組織中NGAL的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1 NGAL原核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出約625bp的目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致。重組質(zhì)粒pET28a-NGAL轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Rosetta DE3，經(jīng)HindⅢ、BamHⅠ雙酶切，分別在5369bp和625bp處有兩條清晰的條帶，與質(zhì)粒pET28a和NGAL基因片段的分子量一致，測序結(jié)果與pET28a載體多克隆位

8、點及NGAL序列進(jìn)行同源比較后，證明融合區(qū)域的讀碼框正確，并有正確的方向，表明質(zhì)粒pET28a-NGAL克隆正確。
　　 2 NGAL融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
　　 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化經(jīng)1mM IPTG誘導(dǎo)3 h后，分別收集上清及菌體，行聚丙稀酰胺凝膠電泳后，考馬斯亮藍(lán)染色。染色結(jié)果顯示：融合蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中，IPTG誘導(dǎo)的融合蛋白電泳后在25KD左右位置發(fā)現(xiàn)明顯深染蛋白條帶，而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的融合蛋白未見該條帶

9、。并且隨著IPTG誘導(dǎo)時間的增加，蛋白表達(dá)量也增加，3小時后達(dá)到高峰，以后隨著誘導(dǎo)時間的延長表達(dá)量沒有明顯變化。實驗證明：融合蛋白pET28a-NGAL在Rosetta DE3菌體中得到了高效表達(dá)。Quantity One分析融合蛋白表達(dá)率為12.2％。
　　 3 NGAL多克隆抗體的制備
　　 大量擴(kuò)增誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)后，收集包涵體形式的融合蛋白，行SDS-PAGE電泳，切取目的蛋白染色膠帶，PBS溶解凝膠顆粒，測蛋白

10、濃度，按照每只兔子每次需要0.3mg蛋白量計算免疫動物，收集純化蛋白，按照免疫兔所需要的融合蛋白量進(jìn)行免疫。3次增強(qiáng)免疫結(jié)束后，采集并分離血清，純化血清免疫球蛋白IgG。
　　 4 NGAL多克隆抗體的鑒定
　　 Western blot檢測融合總蛋白和切膠純化蛋白。ECL顯色結(jié)果顯示，自制抗體可在預(yù)期位置檢測出目的條帶。免疫組化結(jié)果顯示，NGAL在乳腺癌組織中有陽性表達(dá)，蛋白定位主要在細(xì)胞質(zhì)。上述結(jié)果表明，自制NGAL