可溶修飾型綠色熒光蛋白（smGFP）的原核表達(dá)純化及多克隆抗體制備.pdf

1、本研究對可溶修飾型綠色熒光蛋白smGFP進行原核表達(dá)、純化并制備其多克隆抗體。 通過體外DNA重組技術(shù)，將來源于pCAMBIA1301-smGFP質(zhì)粒上的目的基因smGFP片段在T<,4> DNA連接酶的作用下，插入到原核表達(dá)載體pET-28a(+)的Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切位點之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)-smGFP。經(jīng)過PCR擴增鑒定、酶切鑒定以及DNA序列分析，插入的目的基因smGFP的序列完全正確。將重

2、組質(zhì)粒pET-28a(+)-smGFP轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，加入終濃度為1.0 mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后表達(dá)出肉眼可見的分子量大約為30 kDa的smGFlP融合蛋白，該smGFP融合蛋白以可溶形式存在，擴大培養(yǎng)濃縮后在變性條件下經(jīng)Ni離子親和層析得到純品smGFP融合蛋白。用Bradford法測定該融合蛋白含量約為700 μg

3、/ml。用純化的smGFP融合蛋白免疫三只6-8周齡的BALB/c小鼠(15 μg/只，次)三次后，進行ELISA檢測，獲得的smGFP融合蛋白的多克隆抗體以1∶32000的比例稀釋后仍可檢測到0.025 μg左右的抗原(融合蛋白smGFP)。用制備的多克隆抗體Western-blot檢測smGFP融合蛋白，AEC化學(xué)顯色后，在硝酸纖維素膜上顯示出明顯的單一的特異性目的帶。以上結(jié)果表明通過原核表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá)出了smGFP融合蛋