人新基因EOLA1的原核表達、蛋白純化及多克隆抗體制備.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是多器官功能障礙(MODS)的前兆，是當前危重病醫(yī)學(xué)面臨的難題之一，它也是導(dǎo)致嚴重?zé)齻?、?chuàng)傷患者死亡的主要原因之一；其發(fā)病機制與內(nèi)毒素(LPS)激活血管內(nèi)皮細胞誘發(fā)并加重全身炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。膿毒癥的病理生理機制復(fù)雜，現(xiàn)行的治療措施有限，因此我們深入研究其發(fā)病機制就顯得尤為重要。 近年來，由于血管內(nèi)皮細胞是內(nèi)毒素作用的直接靶細胞之一，國內(nèi)外對LPS激活內(nèi)皮細胞的作用途徑、特異受體、胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面研究較多

2、。本研究室前期應(yīng)用抑制消減雜交和cDNA末端擴增技術(shù)(RACE)，從LPS刺激后的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中克隆到一個人類新基因全長cDNA序列，經(jīng)Northernblot驗證后作為人類新基因被GenBank全長序列庫所接受(No.AY074889)。因其在受LPS刺激的內(nèi)皮細胞中上調(diào)表達，故暫時命名為內(nèi)皮高表達脂多糖相關(guān)因子1(endothelial-overexpressedlipopolysaccharide-associatedfact

3、or1，EOLA1)。 目前，國外尚無關(guān)于該基因的相關(guān)研究，本實驗室對EOLA1基因做了一些前期研究工作，并經(jīng)生物信息學(xué)分析顯示：該基因全長1404個bp，其定位于染色體Xq27.4，編碼蛋白由158個氨基酸組成，分子量17.89kDa，等電點6.43，親水性好，為可溶性蛋白。其二級結(jié)構(gòu)含α螺旋、β片層結(jié)構(gòu)和β轉(zhuǎn)角，并形成一個螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋(HTH)基序。EOLA1氨基酸序列包含N-糖基化位點、PKC磷酸化位點和酪氨酸激酶2磷

4、酸化位點。 多組織Northernblot顯示EOLA1基因除在LPS刺激的內(nèi)皮細胞上調(diào)表達外，在骨胳肌、心臟、腎臟、肝臟和胎盤有較強的表達，在結(jié)腸、小腸、脾臟有較弱的表達，而在腦、胸腺、肺和外周白細胞則未見表達。在7種癌細胞株上，顯示在早幼粒白血病系HL-60、海拉細胞系S3、慢性骨髓性白血病系K-562和肺癌細胞系A(chǔ)549都有表達，而在成淋巴細胞瘤性白血病MOLT-4和結(jié)直腸腺癌SW480表達水平最高，但在黑素瘤G-361無

5、表達。在經(jīng)過G418壓力篩選后的穩(wěn)定表達EGFP-EOLA1(enhancedgreenfluorescentprotein-EOLA1)融合蛋白的ECV304細胞株中發(fā)現(xiàn)EOLA1蛋白為全細胞分布。酵母雙雜交顯示EOLA1蛋白與細胞內(nèi)金屬硫蛋白相互作用，可能參與細胞生長和凋亡及抗炎癥等多種生物學(xué)作用。目前該基因的功能未知，本課題擬制備抗EOLA1抗體，為研究其功能奠定基礎(chǔ)。 本研究從該基因克隆開始，進行了原核表達重組質(zhì)粒構(gòu)建，

6、在大腸桿菌中進行蛋白的誘導(dǎo)表達，經(jīng)過蛋白純化與復(fù)性后，免疫接種小鼠獲得多克隆抗體并初步鑒定，為后期功能研究做基礎(chǔ)工作。 本研究的主要結(jié)果和結(jié)論如下：從ECV304細胞中抽提到總RNA后，應(yīng)用RT-PCR方法克隆到目的基因片段，瓊脂糖凝膠電泳驗證約500bp大小，應(yīng)用PET-46EK/LIC空質(zhì)粒和RT-PCR產(chǎn)物構(gòu)建重組質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化到非表達宿主菌(NovaBlueGigaSinglesTM)后，菌落PCR方法篩選鑒定，測序證明與E

7、OLA1基因開放閱讀框序列完全吻合，進一步驗證EOLA1基因的真實性和準確性，PET-46EK/LIC-EOLA1重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)plysS中，成功誘導(dǎo)表達出EOLA1重組蛋白，主要以包涵體形式在胞質(zhì)不溶性表達，分子量大小約20kDa左右；用帶組氨酸(His)標簽的鼠單抗作為一抗，進行WesternBlot能夠驗證特異表達的蛋白條帶。經(jīng)過蛋白表達條件的優(yōu)化，確定最佳誘導(dǎo)條件為在宿主表達菌BL2

8、1(DE3)plysS中37℃誘導(dǎo)4h，Amp100μg/ml，IPTG濃度為1mmol/L。 EOLA1蛋白大量表達：誘導(dǎo)2000ml菌液，離心獲得菌體濕重9.6g，經(jīng)破菌、洗滌獲得初步純化的包涵體蛋白濕重0.76g，經(jīng)親和層析和透析復(fù)性后獲得100ml目的蛋白溶液，BCA蛋白定量法測得其濃度為124.16ug/ml，SDS-PAGE及WesternBlot分析鑒定純化結(jié)果。肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)分析顯示：目的蛋白經(jīng)酶解后能