家蠶基因BmNPC1的克隆及功能分析.pdf

1、人類C型尼曼匹克病（Niemann-Pick disease type C，NP-C）是一種罕見(jiàn)的，進(jìn)展性的且不可逆的疾病，為常染色體隱性遺傳，常導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能缺失甚至早逝。95%患者是由于NPC1基因突變導(dǎo)致的膽固醇代謝障礙，另5%是NPC2基因突變所致。作為導(dǎo)致C型尼曼匹克病的主要因素，NPC1參與細(xì)胞內(nèi)的膽固醇運(yùn)輸，編碼位于溶酶體和核內(nèi)體膜上的13次跨膜蛋白。NPC1突變的細(xì)胞內(nèi)膽固醇異常堆積于核內(nèi)體/溶酶體中。NPC1基因已經(jīng)

2、被發(fā)現(xiàn)有較多的功能，主要是：NPC1參與運(yùn)輸細(xì)胞內(nèi)膽固醇；NPC1蛋白又被證實(shí)有跨膜分子泵活性；在針對(duì)于埃博拉病毒的研究中，NPC1蛋白被發(fā)現(xiàn)與埃博拉病毒感染細(xì)胞相關(guān)。以果蠅為例的昆蟲(chóng)中 NPC1參與膽固醇運(yùn)輸外還被發(fā)現(xiàn)與蛻皮以及精子形成相關(guān)，且有兩個(gè)直系同源物，NPC1a和NPC1b。而關(guān)于家蠶中NPC1基因功能尚無(wú)報(bào)道。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)NPC1進(jìn)行基本信息分析及比對(duì)并設(shè)計(jì)引

3、物，BmNPC1的全長(zhǎng)通過(guò)RACE技術(shù)獲得。BmNPC1基因cDNA全長(zhǎng)4591bp，其中ORF閱讀框?yàn)?702bp,位于第三號(hào)染色體上。編碼1233個(gè)氨基酸，蛋白大小為137.44kD，含有一個(gè)膽固醇結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且該蛋白13次跨膜。選取各物種的NPC1蛋白序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，結(jié)果顯示BmNPC1與果蠅的NPC1親緣關(guān)系最近。⑵取家蠶五齡三天的所有組織和從四齡至熟蠶整個(gè)時(shí)期的家蠶血液，并用來(lái)提取cDNA作為模板，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)

4、BmNPC1的表達(dá)情況。結(jié)果表明，BmNPC1在五齡三天所有組織中表達(dá)，且在精巢、卵巢以及血液和馬氏管中表達(dá)量比較高。在血細(xì)胞中的表達(dá)量與時(shí)期相關(guān)，當(dāng)家蠶處于變態(tài)期時(shí)該基因大量表達(dá)。⑶BmNPC1的多克隆抗體通過(guò)以下四步制備：構(gòu)建重組的原核表達(dá)載體pET32，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)蛋白的大量表達(dá)，在包涵體中的蛋白的純化，以及5次小鼠免疫。最終獲得了BmNPC1的小鼠多克隆抗體。利用ELISA測(cè)定抗體效價(jià)，之后Western blot檢測(cè)獲得的

5、條帶大小與BmNPC1預(yù)測(cè)的蛋白分子量一致。家蠶血液和家蠶細(xì)胞系(SID-1)的免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，與哺乳動(dòng)物相同（NPC1蛋白定位于溶酶體膜和核內(nèi)體膜），BmNPC1蛋白同樣出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中。表明抗體制備有效，可用的，為下一步實(shí)驗(yàn)做了良好的基礎(chǔ)。⑷設(shè)計(jì)并合成雙鏈干涉片段，細(xì)胞水平上通過(guò)雙鏈干涉片段干涉 SID-1細(xì)胞，F(xiàn)ilipinⅢ染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中膽固醇發(fā)生明顯聚集，推測(cè)家蠶BmNPC1與細(xì)胞的膽固醇運(yùn)輸相關(guān)；個(gè)體水平上雙鏈干涉片段注射蠶