短小芽胞桿菌脂肪酶在畢赤酵母中的分泌表達(dá).pdf

1、隨著脂肪酶被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)具有各種特性的脂肪酶已成為一個亟待解決的問題。短小芽孢桿菌脂肪酶具分子量小，表達(dá)、分泌能力強(qiáng)，非水相體系酶學(xué)性質(zhì)突出等優(yōu)點，是具有較好應(yīng)用前景的脂肪酶。本實驗通過構(gòu)建短小芽孢桿菌脂肪酶基因及其定向突變后的基因表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化到適合工業(yè)化生產(chǎn)的巴斯德畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)，為短小芽孢桿菌脂肪酶的工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)行了有益探索。 本實驗以經(jīng)過定向突變得到的脂肪酶突變基因BpL-1369

2、和其野生型基因BpL為材料，構(gòu)建成含有短小芽孢桿菌野生型及其定向突變基因的表達(dá)載體pPIC9K-BpL和pPIC9K-BpL-1369，通過電轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中；利用G418 篩選獲得高拷貝重組酵母菌株，并經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，實現(xiàn)了芽孢桿菌脂肪酶在畢赤酵母中的分泌表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測表明，其表觀分子量約為25 Kda。工程菌經(jīng)正交實驗初步優(yōu)化后，獲得最佳誘導(dǎo)條件。GS115/pPIC9K-BpL最佳誘導(dǎo)條件

3、為：甲醇添加量1.0％/24h，初始菌濃度4.0（OD600），初始pH 7.0，收獲時間96h；GS115/pPIC9K-BpL-1369的最佳誘導(dǎo)條件為：甲醇添加量1.0％/24 h，初始菌濃度4.0（OD600），初始pH 7.0，收獲時間108 h。在上述最優(yōu)條件下，GS115/pPIC9K-BpL脂肪酶的酶活從優(yōu)化前的1.60 U/mL提高到4.95 U/mL；GS115/pPIC9K-BpL-1369 脂肪酶的酶活從1.85