豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2、GP5和N蛋白單克隆抗體的制備.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Productive and Respiratory Syndrome，PRRS）是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Productive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)，歸屬于動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬。但由于PRRSV擁有嚴(yán)格的宿主細(xì)胞特異性、抗體依賴性增強(qiáng)作用、廣泛的毒株變異現(xiàn)象和持續(xù)

2、性感染等特性而使針對(duì)該病的免疫預(yù)防沒(méi)有得到任何實(shí)質(zhì)性突破。
　　 本研究旨在(1)探明浙江地區(qū)PRRSV Nsp2基因的分子變異特征;(2)制備Nsp2、GP5和N蛋白的單克隆抗體;(3)建立PRRSV N蛋白的Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。
　　 1.應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)2008-2009年采集于浙江省部分發(fā)病豬場(chǎng)的41份疑似PRRS病豬的脾、肺及淋巴結(jié)混合組織樣本進(jìn)行PRRSV Nsp2基因序列分析。結(jié)果顯

3、示，41份PRRSV分離毒株中有20份Nsp2部分缺失，與國(guó)內(nèi)分離毒株JXA1、HuN、HUN4等具有相同的缺失特征。41個(gè)分離株間同源性高達(dá)89.2％～100％，其中20個(gè)缺失株間的核苷酸同源性為94.2％～99.8％;21個(gè)非缺失株間的核苷酸同源性為99.2％～100％。
　　 2.將原核表達(dá)的重組Nsp2、GP5和N蛋白作為抗原免疫BALB/c小鼠，取脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合，ELISA和IFA鑒定陽(yáng)性后有限稀釋法篩選單克隆

4、，獲得4株抗Nsp2、1株抗GP5和1株抗N蛋白的特異性單抗，命名為Nsp2:1A5、1D8、1F1和3H7，GP5:4A3，N:5E10。4株抗Nsp2和1株抗N蛋白的單抗均能通過(guò)ELISA、IFA和Western blot方法鑒定，測(cè)定ELISA效價(jià)為(Nsp2:1∶20000;N:1∶1000)，說(shuō)明識(shí)別抗原線性表位;1株抗GP5單抗并不能通過(guò)ELISA和Western blot方法鑒定，其IFA效價(jià)為1∶500，說(shuō)明識(shí)別抗原構(gòu)象

5、表位。
　　 3.RT-PCR方法擴(kuò)增PRRSV JX株N蛋白基因，將其克隆于質(zhì)粒pFastBacTMHTA中，構(gòu)建的重組供體質(zhì)粒pFastBacTM HT A-N轉(zhuǎn)化于DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中發(fā)生轉(zhuǎn)座，得到的重組轉(zhuǎn)座子reBacmid-N轉(zhuǎn)染至昆蟲(chóng)細(xì)胞sf9中，并進(jìn)行重組桿狀病毒的包裝。通過(guò)SDS-PAGE、Western-blot和IFA試驗(yàn)對(duì)所表達(dá)的蛋白進(jìn)行鑒定和反應(yīng)原性分析。結(jié)果顯示，經(jīng)Bac-to-Bac桿狀病毒系統(tǒng)