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文檔簡(jiǎn)介
1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Productive and Respiratory Syndrome,PRRS)是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Productive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV),歸屬于動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬。但由于PRRSV擁有嚴(yán)格的宿主細(xì)胞特異性、抗體依賴性增強(qiáng)作用、廣泛的毒株變異現(xiàn)象和持續(xù)
2、性感染等特性而使針對(duì)該病的免疫預(yù)防沒(méi)有得到任何實(shí)質(zhì)性突破。
本研究旨在(1)探明浙江地區(qū)PRRSV Nsp2基因的分子變異特征;(2)制備Nsp2、GP5和N蛋白的單克隆抗體;(3)建立PRRSV N蛋白的Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。
1.應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)2008-2009年采集于浙江省部分發(fā)病豬場(chǎng)的41份疑似PRRS病豬的脾、肺及淋巴結(jié)混合組織樣本進(jìn)行PRRSV Nsp2基因序列分析。結(jié)果顯
3、示,41份PRRSV分離毒株中有20份Nsp2部分缺失,與國(guó)內(nèi)分離毒株JXA1、HuN、HUN4等具有相同的缺失特征。41個(gè)分離株間同源性高達(dá)89.2%~100%,其中20個(gè)缺失株間的核苷酸同源性為94.2%~99.8%;21個(gè)非缺失株間的核苷酸同源性為99.2%~100%。
2.將原核表達(dá)的重組Nsp2、GP5和N蛋白作為抗原免疫BALB/c小鼠,取脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合,ELISA和IFA鑒定陽(yáng)性后有限稀釋法篩選單克隆
4、,獲得4株抗Nsp2、1株抗GP5和1株抗N蛋白的特異性單抗,命名為Nsp2:1A5、1D8、1F1和3H7,GP5:4A3,N:5E10。4株抗Nsp2和1株抗N蛋白的單抗均能通過(guò)ELISA、IFA和Western blot方法鑒定,測(cè)定ELISA效價(jià)為(Nsp2:1∶20000;N:1∶1000),說(shuō)明識(shí)別抗原線性表位;1株抗GP5單抗并不能通過(guò)ELISA和Western blot方法鑒定,其IFA效價(jià)為1∶500,說(shuō)明識(shí)別抗原構(gòu)象
5、表位。
3.RT-PCR方法擴(kuò)增PRRSV JX株N蛋白基因,將其克隆于質(zhì)粒pFastBacTMHTA中,構(gòu)建的重組供體質(zhì)粒pFastBacTM HT A-N轉(zhuǎn)化于DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中發(fā)生轉(zhuǎn)座,得到的重組轉(zhuǎn)座子reBacmid-N轉(zhuǎn)染至昆蟲(chóng)細(xì)胞sf9中,并進(jìn)行重組桿狀病毒的包裝。通過(guò)SDS-PAGE、Western-blot和IFA試驗(yàn)對(duì)所表達(dá)的蛋白進(jìn)行鑒定和反應(yīng)原性分析。結(jié)果顯示,經(jīng)Bac-to-Bac桿狀病毒系統(tǒng)
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