位置非特異性脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及脂肪酶基因的表達(dá).pdf

1、脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)是一類重要的甘油酯鍵水解酶,廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中,可以在油水界面上催化脂類物質(zhì)分解、合成和酯交換等反應(yīng),是最早研究的酶類之一。微生物脂肪酶具有種類多、比動(dòng)植物脂肪酶具有更廣的作用pH值和作用溫度范圍、便于進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)和獲取高純度制劑等優(yōu)點(diǎn)而在多個(gè)行業(yè)得到廣泛應(yīng)用。不同種屬的微生物所產(chǎn)生的脂肪酶具有不同的催化特性,因此人們致力于發(fā)現(xiàn)具有不同優(yōu)良特性的脂肪酶產(chǎn)生菌以滿足不同的工業(yè)生產(chǎn)需求。

2、脂肪酶的位置非特異性可以提高水解及轉(zhuǎn)酯等反應(yīng)的效率,適用于生物柴油生產(chǎn)、洗滌添加劑等領(lǐng)域.另外具有高活力是脂肪酶應(yīng)用的首要前提。本文旨在通過從自然界篩選以及建立基因工程菌等手段獲得具有多種優(yōu)良性狀的脂肪酶產(chǎn)生菌,為位置非特異性脂肪酶的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本研究主要內(nèi)容包括以下幾部分:
　　 1.從油脂污染的土壤中篩選高產(chǎn)脂肪酶的菌株。利用以橄欖油為唯一碳源的平板進(jìn)行初篩,再用羅丹明B平板及吐溫-80平板進(jìn)行復(fù)篩。從復(fù)篩平板上得到40株

3、脂肪酶活力較高的菌株,對(duì)其進(jìn)行液體培養(yǎng)檢測(cè)產(chǎn)酶能力,并用薄層層析法檢驗(yàn)所產(chǎn)脂肪酶水解底物的位置選擇性。最后得到一株活力高(76 U/mL)、具有位置非特異性的脂肪酶產(chǎn)生菌,命名為S31。經(jīng)表型、生理生化及16S rRNA序列鑒定,確定其為Burkholderiacepacia(洋蔥伯克霍爾德氏菌)。
　　 2.對(duì)S31菌株發(fā)酵的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化組合。通過單因子實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)考查了影響產(chǎn)酶的內(nèi)外部因素,確定S31產(chǎn)脂肪酶的

4、最優(yōu)條件為:以2％麩皮、1％蛋白胨、0.05％MgSO4、4％Tween-80和0.2％K2HPO4為培養(yǎng)基(pH7),250 mL三角瓶裝40mL培養(yǎng)基,3％接種量,30℃,180 rpm培養(yǎng)66 h,酶活達(dá)283.6 U/mL。
　　 3.從S31發(fā)酵液中分離出電泳純的脂肪酶,并研究其催化特性及穩(wěn)定性。通過硫酸銨沉淀、離子交換和凝聚過濾實(shí)驗(yàn),從S31發(fā)酵液中分離出一條約35 kDa、具有脂肪酶活力的蛋白條帶。純化倍數(shù)為19.

5、8,回收率為13.3％。
　　 S31脂肪酶最適溫度為65—70℃,同時(shí)該酶在高溫下也相當(dāng)穩(wěn)定:55℃處理12 h后殘留85％的酶活,70℃溫育1 h后保留80％的活性。S31脂肪酶最適pH為9,在pH7-10之間保持較高的活性,且對(duì)酸堿具有較好的耐性,在pH5-9的緩沖液中處理12 h后能保留80％以上的活性。Ca2+、Mn2+、K+、Na+和Mg2+對(duì)S31脂肪酶具有激活作用,而Fe2+、Cu2+對(duì)酶活有抑制作用。S31脂肪

6、酶在常見的有機(jī)溶劑,如甲醇、甘油、正己烷、正丁醇,甲苯和乙酸乙酯中都具有很好的穩(wěn)定性,其中乙酯、正丁醇和正己烷能提高酶的活性。通過脂肪酶對(duì)不同脂肪酸酯的催化結(jié)果顯示,S31脂肪酶具有較為廣泛的底物范圍,其中對(duì)中鏈脂肪酸酯的催化效率最高。
　　 4.通過PCR方法擴(kuò)增了B.cepacia S31脂肪酶基因,并將其轉(zhuǎn)化到枯草桿菌中進(jìn)行外源表達(dá).S31脂肪酶基因lipA包含1095個(gè)堿基,編碼364個(gè)氨基酸。其下游基因lipB包含10

7、35個(gè)堿基,編碼344個(gè)氨基酸,兩基因間隔3個(gè)堿基。LipB是脂肪酶LipA正確折疊分泌必不可缺少的分子伴侶。lipA基因5’端含有120個(gè)編碼脂肪酶信號(hào)肽的堿基序列。基因在GenBank上的登錄號(hào)為FJ638612。
　　 以pHT43為載體,將S31脂肪酶基因(lipA,lipB)導(dǎo)入枯草桿菌DB104內(nèi),在IPTG誘導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)。在添加0.5％Triton X-100的MSR培養(yǎng)基中誘導(dǎo)54 h后,酶活達(dá)到135 U

8、/mL。同時(shí)對(duì)宿主DB104電擊轉(zhuǎn)化的條件進(jìn)行了改良。在電擊緩沖液中添加0.5 M海藻糖,并在菌體培養(yǎng)至OD1.0-1.2時(shí)制作感受態(tài)細(xì)胞,可以使轉(zhuǎn)化率較改良前提高10倍。
　　 5.對(duì)Proteus vulgaris脂肪酶基因進(jìn)行克隆和外源表達(dá)。P.vulgaris(普通變形桿菌)T6是本實(shí)驗(yàn)室篩選保存的另一個(gè)產(chǎn)脂肪酶的菌株,所產(chǎn)脂肪酶具有位置非特異性,對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸酯具有較好的親和性。本實(shí)驗(yàn)將T6脂肪酶基因(PVL)與pET-

9、DsbA載體連接,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)內(nèi)表達(dá),成功獲得了重組脂肪酶,并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。pET-DsbA-PVL在BL21內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件為:以添加15 mg/mL葡萄糖和200μg/mL Amp的LB(pH8.5)作為培養(yǎng)基,菌體濃度培養(yǎng)至OD600為1.2時(shí),加入100μg/mL IPTG、15℃誘導(dǎo)15 h時(shí),最高酶活達(dá)到192.2 U/mL。對(duì)重組菌BL21[pET-DsbA-PVL]表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行親扣層析純化

10、,得到電泳純的普通變形桿菌脂肪酶蛋白(PVL),分子量約為31 kDa。外源表達(dá)脂肪酶的性質(zhì)與野生酶性質(zhì)相似。
　　 6.構(gòu)建了組成型表達(dá)載體pMMP43。對(duì)枯草桿菌載體pMM1525進(jìn)行改造,將其木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換成枯草高效組成型啟動(dòng)子P43,得到載體pMMP43。將PVL基因連接到pMMP43內(nèi),在枯草桿菌WB800中獲得了分泌表達(dá)。pMMP43-PVL在WB800內(nèi)表達(dá),培養(yǎng)48h酶活達(dá)到60 U/mL。還將PVL基因插