組蛋白乙?；瘜撬栝g充質干細胞向平滑肌細胞分化的調控作用及機制.pdf

1、括約肌功能障礙（ISD）是壓力性尿失禁（SUI）的主要原因，現(xiàn)有的治療方法包括手術治療和非手術治療，但這些方法僅改變了盆底解剖結構，均不能糾正ISD，不能從本質上恢復患者的括約肌功能。鑒于近年來運用干細胞移植修復肌肉損傷、改善肌肉收縮功能的報道，人們對干細胞移植治療SUI 寄予厚望。然而至今為止該療法并沒有獲得預期的療效，究其原因是由于干細胞移植后既往的研究僅關注了移植后細胞表型的變化，對其在體內外分化的機制研究甚少，導致人們不能很好的

2、運用其分化的能力達到治療疾病的目的，因此研究干細胞在體內外微環(huán)境誘導下的適應性變化及機制顯得十分重要。
　　 近年來，組蛋白修飾對干細胞分化的影響引起了人們的關注，組蛋白修飾是指不改變細胞DNA 序列，通過組蛋白亞基發(fā)生乙?；?、甲基化等共價修飾，這些修飾可為基因的表達提供一種識別的標志，為其他蛋白與DNA的結合產生協(xié)同或拮抗效應，它是一種動態(tài)轉錄調控成分，稱為組蛋白密碼。這些密碼可被特定蛋白質識別，將其翻譯成特定的染色質狀態(tài)以實

3、現(xiàn)對特定基因的調節(jié)，其中，與特異性基因轉錄調控關系最為密切的是組蛋白乙酰化修飾，研究表明，組蛋白H3 亞基上賴氨酸殘基的乙?；谌旧|包裝和基因轉錄調控中扮演著重要的角色。一般而言，組蛋白H3K9 乙酰化與基因的活化有著密切的關系，相反的，H3K9 去乙酰化與基因的沉默相關。一旦有乙?；拇嬖冢珼NA的構型發(fā)生松解，轉錄因子得以與核小體中相應的順式作用原件結合同時募集相應反式作用因子，啟動基因轉錄。那些組蛋白乙?；潭让芗膮^(qū)域，其下游

4、的DNA呈現(xiàn)出非?；钴S的轉錄狀態(tài)。那么干細胞進入特定的微環(huán)境以后，是否也是通過其特定基因發(fā)生了組蛋白修飾，實現(xiàn)其在特定環(huán)境下重新編程產生與環(huán)境細胞類似的微環(huán)境適應性呢？
　　 骨髓間充質干細胞(bone mesenchymAlstem cells, BMSCs)是一小群存在于骨髓中的非造血細胞，它具有增殖和多向分化潛能。BMSCs 具有取材方便、擴增迅速、可自體移植等特點，因此，將其作為種子細胞用于細胞治療已成為當前研究的熱點。

5、本實驗取材于雌性SD大鼠，分別利用密度梯度離心法和膠原酶消化法，分離培養(yǎng)了BMSCs和BSMCs；并模擬盆底環(huán)境，運用接觸共培養(yǎng)方法建立誘導BMSCs 向膀胱平滑肌分化的體外模型，旨在研究BMSCs 體外分化為平滑肌過程中，平滑肌相關基因啟動子區(qū)組蛋白乙?；绞欠癜l(fā)生改變，組蛋白乙?；降母淖儗MSCs 向BSMCs分化的影響。主要實驗方法及結果如下：
　　 一、細胞培養(yǎng)鑒定及共培養(yǎng)模型的建立
　　 1.大鼠BMS

6、Cs的分離與培養(yǎng) 無菌操作下取下一月齡雌性SD大鼠雙側股骨、脛骨，反復沖洗骨髓腔，混勻沖洗液，離心棄上清后precoll 提取所需單核細胞層，加入含10％FBS的DMEM-F12 培養(yǎng)液中，置37 ℃的5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所得貼壁細胞，流式細胞儀檢測其分子表型。結果：成功分離出形態(tài)為梭形的骨髓單核細胞，其分子表型為：CD31、CD45 陰性、CD29、CD44、CD166 陽性。
　　 2.大鼠BSMCs的分離與培養(yǎng) 無菌

7、條件下取一月齡雌性SD大鼠膀胱，采用膠原酶消化法分離單個核細胞，含10％FBS的HG-DMEM 培養(yǎng)，獲得貼壁細胞，免疫熒光法鑒定其標志蛋白的表達。結果：平滑肌特異性的a-SMA, Calponin和 SM-MHC表達陽性。
　　 3.建立大鼠BSMCs 誘導BMSCs分化的體外共培養(yǎng)模型 以懸掛式細胞培養(yǎng)小室transwell 底層的多孔膜(1um)作為BMSCs和BSMCs 之間的間隔，將BMSCs和BSMCs分別接種于多孔

8、膜兩側作為實驗組，未經過接觸共培養(yǎng)的同批次BMSCs作為對照組。取下接觸共培養(yǎng)3日后BMSCs，RT-PCR 檢測其與對照組成肌分化平滑肌標志性蛋白。結果：RT-PCR 顯示接觸共培養(yǎng)組較對照組的BMSCs中平滑肌標志性蛋白的表達量明顯增加，提示BMSCs在接觸共培養(yǎng)體系中成肌分化，建模成功。
　　 二、組蛋白乙?；瘜MSCs 向BSMCs分化的影響
　　 1.ChIP、qPCR分析平滑肌標志性基因啟動子區(qū)組蛋白乙?；?/p>

9、水平對BMSCs 向平滑肌分化的影響 實驗采用ChIP 技術，在活細胞狀態(tài)下甲醛固定共培養(yǎng)前后BMSCs中蛋白質-DNA 復合物，超聲打斷染色質片段，調整片段大小在200-1000bp，然后通過抗組蛋白特定乙?；稽cH3K9抗體沉淀分化前后BMSCs基因組，定量PCR擴增BMSCs中平滑肌標志性基因啟動子區(qū)DNA 片段，了解干細胞分化前后啟動子區(qū)域乙?；潭鹊淖兓闆r，從而獲得蛋白質與DNA 相互作用的信息。結果：共培養(yǎng)誘導分化后，BM

10、SCs平滑肌標志性基因啟動子區(qū)乙酰化程度較未分化前明顯增加，啟動子區(qū)域DNA的乙酰化促進了BMSCs 向BSMCs分化。
　　 2、組蛋白去乙?；敢种苿℉DACi）丁酸鈉對BMSCs分化的影響 將二代BSMCs種植于懸掛式細胞培養(yǎng)小室transwell下室面，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后翻轉transwell 將其放回含平滑肌培養(yǎng)液的六孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。次日將BMSCs種植于膜內面。分組標記，實驗組上室內加入含3.0mmol/L 丁酸

11、鈉的BMSCs 培養(yǎng)液，對照組加入普通BMSCs 培養(yǎng)液，分別取下培養(yǎng)1、2、3天BMSCs，細胞免疫熒光、qPCR分析不同時間段BMSCs 向BSMCs分化的情況。結果：HDACi 丁酸鈉可以增強骨髓間充質干細胞向平滑肌的分化能力，提高組蛋白乙?；潭瓤梢源龠MBMSCs分化。結論：本研究成功分離出BMSCs及BSMCs，并模擬體內環(huán)境建立了誘導分化模型，在該模型的基礎上研究組蛋白乙?；瘜MSCs分化能力的影響。研究表明，干細胞分化后