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文檔簡介
1、目的:
1)誘導(dǎo)人脂肪干細(xì)胞(hunan adipose derived stem cells,hASCs)向平滑肌細(xì)胞分化并鑒定;
2)探討miR-145在hASCs向平滑肌細(xì)胞分化過程中的表達(dá)及作用;
3)預(yù)測miR-145的作用靶基因,并確定miR-145及其靶基因?qū)ASCs向平滑肌細(xì)胞分化過程中的作用機(jī)制;
4)闡明鈣離子/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶Ⅱγ(Ca2+/calmodulin-dep
2、endent protein kinaseⅡγ,CaMKⅡγ)在hASCs向平滑肌細(xì)胞分化過程中的表達(dá)與作用機(jī)制。
方法:
1)分離培養(yǎng)人脂肪干細(xì)胞并鑒定;將第三代hASCs在轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)和骨形態(tài)蛋白4(BMP4)的作用下向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化,用熒光定量PCR、western blot、免疫熒光等方法檢測平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá);
2)hASCs向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)7天以后檢測miR-1
3、45的表達(dá)情況;合成miR-145模擬物及抑制物,并將其轉(zhuǎn)染到hASCs,檢測轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功以后進(jìn)行誘導(dǎo),觀察平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá),并確定miR-145在這過程中的作用;
3)利用生物學(xué)信息查詢初步預(yù)測miR-145的靶基因,經(jīng)過熒光素酶報告基因技術(shù)、miR-145的過表達(dá)及被抑制試驗(yàn),確定miR-145與靶基因之間的作用關(guān)系;檢測靶基因在hASCs向平滑肌誘導(dǎo)時的表達(dá);合成miR-145的靶基因的siRNA干擾載
4、體并轉(zhuǎn)染到hASCs,檢測轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)并檢測平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá);
4)hASCs向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)后檢測CaMKⅡγ表達(dá)。合成CaMKⅡγ的過表達(dá)載體及沉默載體轉(zhuǎn)染到hASCs,檢測轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后進(jìn)行誘導(dǎo)并利用熒光定量PCR、western blot、免疫熒光等方法檢測平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá),確定CaMKⅡγ對hASCs向平滑肌細(xì)胞分化中的作用機(jī)制。
結(jié)果:
1)
5、第三代hASCs在倒置顯微鏡下表現(xiàn)為細(xì)長成纖維樣形態(tài),CD13、CD34、CD44、CD49d、CD90、CD105以及CD166陽性表達(dá),而造血細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的CD14、CD45與CD31陰性表達(dá);hASCs向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)7天后,具有平滑肌細(xì)胞特有的“波峰-波谷”樣生長特點(diǎn)。表達(dá)平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物:a-SMA,SM22a,calponin及SM-MHC;
2)hASCs向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)7天以后miR-145的表達(dá)逐
6、漸增高。miR-145轉(zhuǎn)染到細(xì)胞以后平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá)明顯增高,而miR-145被抑制以后結(jié)果相反;
3)利用生物學(xué)信息查詢及文獻(xiàn)閱讀,初步定KLF-4為miR-145在hASCs向平滑肌細(xì)胞分化中的靶基因,并被熒光素酶報告基因技術(shù)結(jié)果所確定。KLF-4在hASCs向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)過程中表達(dá)逐漸下降。KLF-4被miR-145抑制,而miR-145被抑制以后KLF-4的表達(dá)增高。在hASCs向平滑肌細(xì)胞分化過程中抑制
7、KLF-4導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá)增高;
4)在hASCs向平滑肌細(xì)胞分化過程中CaMKⅡγ的表達(dá)明顯增高。CaMKⅡγ過表達(dá)使平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物的表達(dá)增高,而沉默CaMKⅡγ使hASCs向平滑肌分化被抑制。
結(jié)論:
1)hASCs獲取方便,在普通培養(yǎng)條件下生長良好,并能維持干細(xì)胞的特性,能作為組織工程研究及應(yīng)用的首選種子細(xì)胞;
2)TGF-β1和BMP4能使hASCs向平滑肌細(xì)胞分化
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