細胞間接觸在誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向平滑肌細胞分化中作用的實驗研究.pdf

1、尿失禁是女性的常見病,據(jù)報道全世界患者有2億以上,其中又以壓力性尿失禁為主,已成為重要的婦女健康問題,影響生活質(zhì)量。導(dǎo)致SUI的關(guān)鍵機制主要有兩種,尿道固有括約肌缺陷(intrinsic sphincter deficiency,ISD)和膀胱頸支撐功能障礙。目前,治療SUI的方法包括手術(shù)治療和非手術(shù)治療,但這些方法均只能解決膀胱頸支撐功能障礙,不能糾正ISD,因此長期療效不理想,且并發(fā)癥多。利用干細胞的再生潛能,修復(fù)括約肌缺陷,治療S

2、UI已經(jīng)成為目前尿失禁研究的熱點。
　　 間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)為成體干細胞的一種,是一群來源于中胚層的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞,它們可以在體外經(jīng)誘導(dǎo)后最終分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌腱細胞、肌管、神經(jīng)細胞與支持造血干細胞的基質(zhì)。MSCs具有取材方便、擴增迅速、可自體移植等特點,因此,利用MSCs的多向分化的特性及通過基因修飾能在體外表達多種外源目的基因的特

3、性,將其作為種子細胞用于細胞治療和基因治療的研究已成為當前研究的熱點。但是目前的研究的中,體外誘導(dǎo)它分化產(chǎn)生的平滑肌細胞在數(shù)量和功能上均難以達到改善治療壓力性尿失禁的目的。現(xiàn)階段的研究已證實移植的MSCs能在組織微環(huán)境中分化成與其周圍細胞生物學(xué)特性相似的細胞,認為干細胞能夠?qū)Νh(huán)境中的調(diào)節(jié)信號做出適應(yīng)性改變,而其分子機制尚不清楚,因此本研究模仿體內(nèi)細胞生存的微環(huán)境,將其向SMCs誘導(dǎo),初步探討細胞間接觸在MSCs向SMCs分化中的作用,為

4、MSCs作為種子細胞用于組織工程研究提供理論基礎(chǔ)。
　　 本研究以SD大鼠為研究對象,分別利用密度梯度離心法和酶消化法,分離培養(yǎng)了BMSCs和BSMCs;模仿體內(nèi)細胞生長的微環(huán)境,建立大鼠膀胱平滑肌細胞誘導(dǎo)BMSCs向SMCs分化的體外共培養(yǎng)模型,在共培養(yǎng)前后,檢測膀胱平滑肌細胞誘導(dǎo)BMSCs的成肌分化標志蛋白表達變化:在共培養(yǎng)的基礎(chǔ)上阻斷細胞間縫隙連接,檢測抑制細胞間連接后對BMSCs向SMCs分化情況的影響。主要實驗方法及結(jié)

5、果如下:
　　 一、骨髓間充質(zhì)干細胞和膀胱平滑肌細胞分離培養(yǎng)及鑒定
　　 1.無菌條件下取一月齡雌性SD大鼠雙側(cè)股骨,沖出骨髓,采用密度梯度離心法分離單個核細胞,DMEM-12培養(yǎng),獲得貼壁細胞,監(jiān)測細胞生長曲線,流式細胞儀檢測其免疫表型,采用不同條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)細胞向成脂、成骨分化。和生長情況。結(jié)果:分離的骨髓單核細胞培養(yǎng)后呈紡錘體樣,其分子免疫表型為:CD44、CD90陽性;CD31、CD45陰性。在不同的誘導(dǎo)條件下,

6、BMSCs可形成脂滴、骨結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu),成功分離并培養(yǎng)了BMSCs。
　　 2.無菌條件下取一月齡雌性SD大鼠膀胱,采用胰酶消化法分離單個核細胞,HG-DMEM培養(yǎng),獲得貼壁細胞,監(jiān)測細胞生長曲線,免疫熒光法鑒定其標志蛋白的表達。結(jié)果:平滑肌特異性的a-SMA,Calponin和SM-MHC表達陽性,證實分離并培養(yǎng)了膀胱平滑肌細胞。
　　 二、BMSCs向SMCs分化的體外共培養(yǎng)模型的建立與鑒定
　　 1.建立大鼠BS

7、MCs誘導(dǎo)BMSCs向SMCs分化的體外共培養(yǎng)模型,在共培養(yǎng)前后,檢測BSMCs誘導(dǎo)BMSCs的成肌分化標志蛋白表達變化。以懸掛式細胞培養(yǎng)小室transwell底層的多孔膜(1um)作為BMSCs和BSMCs之間的間隔,細胞分泌的細胞因子,膠原等物質(zhì)可通過膜上的孔相流通,多孔膜上下兩面的細胞可通過膜上的孔進行細胞間接觸,但細胞不能通過。將BMSCs和BSMCs分別接種于多孔膜兩側(cè)作為接觸共培養(yǎng)實驗組,將BMSCs接種于多孔膜上,BSMC

8、s接種于六孔板底,使得兩種細胞仍處在一個培養(yǎng)環(huán)境中,之間距離＜900μm,兩種細胞分泌的細胞因子仍可以通過多孔膜膜孔相互影響,但是不發(fā)生接觸作為非接觸共培養(yǎng)實驗組,以單獨培養(yǎng)的BMSCs作為對照組,在共培養(yǎng)的第4天和第8天的免疫熒光法和Western blot法檢測BMSCs中平滑肌特異性蛋白的表達情況,在共培養(yǎng)1,2,3天檢測實驗組中BMSCs的平滑肌特異性蛋白基因的表達情況。結(jié)果:免疫熒光法、Western blot法和qRT-PC

9、R均顯示隨共培養(yǎng)時間的延長,接觸組的BMSCs中SMC特異的蛋白的表達量增加,而非接觸組與共培養(yǎng)前無明顯變化,提示細胞間的接觸在誘導(dǎo)BMSCs向SMCs分化方面起了重要的作用。
　　 2.正庚醇阻斷細胞間縫隙連接對BMSCs向SMCs分化的影響。初步實驗證明細胞間接觸共培養(yǎng)可以很好的誘導(dǎo)BMSCs向SMCs分化,正庚醇阻斷縫隙連接后可以有明顯的抑制BMSCs向SMCs分化,進一步證明縫隙連接在在誘導(dǎo)BMSCs向SMCs分化方面起