間充質(zhì)干細(xì)胞特化心肌細(xì)胞的組蛋白乙酰化修飾調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的： 篩選本課題組前期對Gcn5(組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶輔激酶)基因設(shè)計的7條質(zhì)粒片段中能高效抑制Gcn5表達(dá)的shRNA序列；探討干擾Gcn5表達(dá)后是否能夠引起體內(nèi)組蛋白乙酰化修飾平衡的改變；觀測下調(diào)組蛋白乙?；揎棤顟B(tài)對體內(nèi)、外MSCs(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)定向分化為心肌細(xì)胞的影響，從而探討組蛋白低乙?；癄顟B(tài)對MSCs定向分化的調(diào)控機(jī)理；建立通過干預(yù)組蛋白乙?；胶鉅顟B(tài)來調(diào)節(jié)MSCs定向分化的“基因調(diào)節(jié)開關(guān)”的理論與實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺

2、。 方法： 采用不同組合質(zhì)粒片段干擾體外培養(yǎng)的MSCs，通過觀察細(xì)胞形態(tài)變化，ELISA技術(shù)檢測MSCs細(xì)胞核蛋白HAT(組蛋白乙?；?活性狀態(tài)，Western-blotting分析MSCs細(xì)胞核Gcn5蛋白表達(dá)，熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光表達(dá)量，流式細(xì)胞技術(shù)檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，篩選有效質(zhì)粒片段；利用篩選出的有效shRNA轉(zhuǎn)染MSCs，通過ELISA技術(shù)檢測MSCs細(xì)胞核HAT活性狀態(tài)，驗(yàn)證通過沉默Gcn5基因是否能

3、夠下調(diào)組蛋白乙?；揎椝?。利用shRNA-ZJ3轉(zhuǎn)染單純MSCs或經(jīng)5-aza(5-氮雜胞苷)處理前后的MSCs，通過觀察細(xì)胞形態(tài)變化，CHIP技術(shù)分析乙?；慕M蛋白H3肽鏈上的相關(guān)基因(Gcn5；GATA-4)表達(dá)，透射電鏡觀測細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，分析下調(diào)組蛋白乙?；揎棤顟B(tài)是否能夠干預(yù)MSCs體外特化心肌細(xì)胞的過程；移植經(jīng)有效shRNA轉(zhuǎn)染的MSCs至大鼠心肌組織，2W后檢測移植區(qū)心肌組織中HAT活性狀態(tài)，Gcn5、GATA-4基

4、因及Gcn5、MHC、Cx43蛋白的表達(dá)狀況，探討心肌微環(huán)境中組蛋白乙?；揎棇SCs特化心肌細(xì)胞的調(diào)控機(jī)理。 結(jié)果： 1、觀察各種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSCs形態(tài)變化顯示經(jīng)shRNA-ZJ3經(jīng)各種預(yù)處理的MSCs較正常MSCs形態(tài)變化最大，生長比較緩慢；shRNA-ZJ3轉(zhuǎn)染的MSCs細(xì)胞核HAT活性及Gcn5蛋白表達(dá)量均明顯降低(P＜0.05)；熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)量及流式細(xì)胞技術(shù)檢測顯示轉(zhuǎn)染效率大于20％。 2

5、、經(jīng)shRNA-ZJ3轉(zhuǎn)染的：MSCs細(xì)胞核內(nèi)HAT?；钚暂^正常MSCs及shRNA-HK(通用陰性質(zhì)粒對照)轉(zhuǎn)染的MSCs明顯降低(P＜0.05)。 3、 5-aza誘導(dǎo)的MSCs細(xì)胞生長旺盛，單純shRNA-ZJ3轉(zhuǎn)染或5-aza誘導(dǎo)前后經(jīng)shRNA-ZJ3轉(zhuǎn)染的MSCs生長遲滯，形態(tài)瘦?。患?xì)胞核蛋白HAT測定顯示：5-aza誘導(dǎo)組乙?；阶罡?，單純轉(zhuǎn)染組(TR組)、誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)染組(IN-TR組)以及轉(zhuǎn)染后誘導(dǎo)組(TR-IN

6、組)與正常組比較HAT活性均有顯著性降低(P＜0.05)，TR組分別與Normal組、Hk組及IN組比較HAT活性降低亦有顯著性(P＜0.05)；經(jīng)5-aza誘導(dǎo)后的MSCs(陽性對照組)與高乙?；浇M蛋白H3相交聯(lián)的Gcn5及GATA-4表達(dá)較正常組(正常培養(yǎng)MSCs組)、陰性對照組(Hk轉(zhuǎn)染組)及實(shí)驗(yàn)組(5-aza誘導(dǎo)后shRNA-ZJ3轉(zhuǎn)染組)均有顯著性增高(P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)組中與高乙?；浇M蛋白H3相交聯(lián)的Gcn5表達(dá)較

7、正常對照組、陰性對照組及陽性對照組均有顯著性的降低(P＜0.05)；電鏡檢測細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)經(jīng)5-aza誘導(dǎo)的MSCs增生活躍，外形長條化，胞漿出現(xiàn)肌絲結(jié)構(gòu)，shRNA-ZJ3轉(zhuǎn)染的MSCs細(xì)胞核中異染色質(zhì)比例增大，部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。 4、體內(nèi)移植區(qū)心肌組織內(nèi)HAT活性檢測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組(shRNA-ZJ3轉(zhuǎn)染MSCs移植組)乙?；富钚暂^正常組(正常心肌組織)、陰性對照組1(shRNA-HK轉(zhuǎn)染組)及陰性對照組2(DAPI標(biāo)記MS

8、Cs移植組)均有顯著性降低(P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)組中可檢測到Gcn5及GATA-4基因的低表達(dá)，較其它三個對照組表達(dá)量均有顯著性降低(P＜0.05)。 結(jié)論： 1、前期課題組構(gòu)建的7條質(zhì)粒片段中shRNA-ZJ3能夠有效干預(yù)Gcn5基因的表達(dá)。 2、shRNA-ZJ3阻斷Gcn5基因表達(dá)后能夠下調(diào)細(xì)胞核組蛋白乙酰化修飾水平，導(dǎo)致組蛋白乙酰化失衡狀態(tài)的出現(xiàn)。 3、組蛋白乙?；揎椘胶鈪⑴c調(diào)控MSCs體外特化