擴(kuò)展青霉脂肪酶的異源表達(dá)及分子突變.pdf

1、擴(kuò)展青霉脂肪酶(PEL)是一類特殊的酯鍵水解酶，可在油水界面催化甘油三酯生成脂肪酸和甘油，在工業(yè)上起著重要的作用。本研究將擴(kuò)展青霉脂肪酶基因(1ip07)導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)中，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)啟動子來表達(dá)PEL。巴斯德畢赤酵母是一種理想的真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，能夠穩(wěn)定高效表達(dá)外源蛋白。利用GAP啟動子，無需像AOXl啟動子那樣，在誘導(dǎo)表達(dá)階段需要剔除非甲醇的碳源，且不以甲醇為誘導(dǎo)物，避免了有

2、毒物質(zhì)的積累。以葡萄糖或甘油為碳源，重組脂肪酶(PEL-pGAPZA-1ip07)均得到了表達(dá)。通過優(yōu)化發(fā)酵條件，酶活從開始的53.0U/ml提高到了221.5U/ml。本研究還利用定點突變技術(shù)對PEL進(jìn)行了分子突變，共獲得了9株脂肪酶突變體。其中PEL-ep8-K202A熱穩(wěn)定性得到很大改善，Tm值比野生型提高了2.63℃，并具備與野生型相當(dāng)?shù)闹久副磉_(dá)量。 一：PEL基因在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)將編碼擴(kuò)展青霉脂肪酶的cDN

3、A(1ip07)克隆到酵母表達(dá)質(zhì)粒pGAPZA，利用Zeocin抗性及限制性酶切鑒定篩選重組表達(dá)載體pGAPZA-lip07，然后電轉(zhuǎn)化宿主菌畢赤酵母GS115，以GAP為啟動子進(jìn)行胞外表達(dá)。橄欖油鑒定板檢驗表明重組菌的發(fā)酵上清具有脂肪酶活性，SDS-PAGE分析得出重組脂肪酶的分子量約為28KD，與野生型擴(kuò)展青霉脂肪酶一致，發(fā)酵上清液中脂肪酶的含量約占分泌蛋白的95％以上。通過優(yōu)化發(fā)酵條件，結(jié)果表明，以甘油作為碳源發(fā)酵表達(dá)PEL，時表

4、達(dá)量最高，以橄欖油為底物進(jìn)行酶活測定，96小時發(fā)酵上清的脂肪酶酶活可達(dá)到221.5U/ml。 二：PEL基因的定點突變?yōu)樘岣邤U(kuò)展青霉脂肪酶的熱穩(wěn)定性，本論文采用重疊延伸PCR的方法對PEL基因進(jìn)行了多個定點突變，包括在野生型lip07上的單點突變和在隨機(jī)突變體ep8(為本課題組構(gòu)建的熱穩(wěn)定性提高的突變脂肪酶)上的疊加突變。將突變后的PEL基因連接到畢赤酵母表達(dá)載體上，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入畢赤酵母GS115構(gòu)建突變脂肪酶基因工程菌。在甲醇

5、的誘導(dǎo)下進(jìn)行突變脂肪酶的表達(dá)并測定其對溫度的敏感性。 (1)K202A單點突變及疊加突變疊加突變體PEL-ep8-K202A的最適作用溫度比野生酶上移了2.0℃，熱穩(wěn)定性(Tm)比野生型提高2.63℃，比隨機(jī)突變體PEL-ep8提高了1.21℃。表達(dá)量約為260.0μg/ml，發(fā)酵酶活約為504.7U/ml，比活力約為1941.0U/mg；單點突變體PEL-lip07-K202A最適作用溫度不變，熱穩(wěn)定性(Tin)比野生型降低

6、1.95℃，表達(dá)量約為125.0μg/ml，發(fā)酵酶活約為273.0U/ml，比活力約為2184.0U/mg。 (2)N73T疊加突變疊加突變體PEL-ep8-N73T最適作用溫度比野生型PEL-lip07降低5℃，熱穩(wěn)定性(Tin)降低0.55℃，表達(dá)量約為40.0μg/ml，發(fā)酵酶活約為71.0U/ml，比活力約為1775.0U/mg。 (3)S153P、Q176P單點突變單點突變體PEL-lip07-Q176P和PEL-l