產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌毒素的不同重組片段的免疫原性比較.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌(toxigenic Pasteurella multocida,T+Pm)是引起豬進行性萎縮性鼻炎(progressive atrophic rhinitis,PAR)的主要致病菌。該病是以面部變形、鼻部扭曲、鼻衄為主要特征的呼吸道傳染病,流行十分廣泛。病豬生長緩慢,飼料利用率降低,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。疫苗免疫是預防和控制該病的主要有效措施。T+Pm分泌的皮膚壞死毒素(Pasteurellamultocida

2、toxin,PMT)是引起PAR最主要的致病因子。PMT是一個弱免疫原,但當其自然結構被破壞后,其免疫原性會增強。部分截短PMT片段被預測為很好的抗原。
  本研究根據(jù)GenBank中已發(fā)表的PMT基因(toxA)序列,設計引物,以T+Pm HN-06株基因組DNA為模板,經(jīng)PCR擴增獲得PMT完整基因,并成功構建克隆質粒pMD18-T-PMT。根據(jù)DNAStar軟件預測分析獲得的PMT親水性基團分布的生物信息,結合相關的研究報道

3、,選取8個不同PMT截短片段作為免疫原性研究的對象。以質粒pMD18-T-PMT為模板,經(jīng)PCR擴增獲得8個截短PMT片段基因,并分別克隆至原核表達載體pET-32a(+)系統(tǒng)中。PCR鑒定、雙酶切鑒定和序列測定結果表明,8個重組PMT片段表達載體均構建成功。以IPTG為誘導劑,分別對8個重組表達菌進行誘導表達。SDS-PAGE結果表明,8個重組PMT片段均成功獲得表達,且以包涵體形式表達為主。Western-blotting結果表明,

4、僅重組PMT1-506aa、 PMT1-391aa、PMT505-1285aa和PMT973-1285aa片段與PMT抗血清有明顯的反應原性。小鼠毒性試驗表明,該4個重組PMT片段均不致死小鼠。對反應原性較好的3個PMT片段進行條件優(yōu)化,以提高其表達量。
  將PMT1-506aa、 PMT1-391aa、 PMT505-1285aa和PMT973-1285aa4個重組PMT片段分別制備疫苗,皮下注射免疫小鼠,間隔14 d進行二免

5、。二免后14 d,用天然PMT進行皮下注射攻毒。結果以2 MLD進行攻毒時,PMT1-506aa(10/10)、PMT505-1285aa(10/10)和PMT973-1285aa(8/10)免疫保護效果顯著優(yōu)于PMT1-391aa(1/10);以5 MLD進行攻毒時,PMT1-506aa(10/10)和PMT505-1285aa(10/10)免疫保護效果顯著優(yōu)于PMT973-1285aa(3/10)和PMT1-391aa(0/10);

6、進一步以10 MLD進行攻毒時,PMT505-1285=(10/10)免疫保護效果顯著優(yōu)于PMT1-506aa(3/10)。小鼠的免疫保護試驗結果表明,4個重組PMT片段中PMT505-1285aa具有較高的免疫保護率。
  選取重組PMT505-1285aa片段制備疫苗,肌肉注射免疫斷奶仔豬,間隔14 d進行二免。二免后14 d,根據(jù)建立的仔豬感染T+Pm模型,進行T+Pm HN-06株新鮮菌液(2×1010 CFU)滴鼻攻毒,

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