豬產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌toxA基因的功能結(jié)構(gòu)域研究.pdf

1、產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌(Toxigenic.Pasteurella multocida，T<'+>Pm)是豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎(Swine progressive atrophic rhinitis，PAR)的主要病原菌之一。它可以產(chǎn)生一種分子量為146kDa的慢性皮膚壞死性毒素——多殺性巴氏桿菌毒素(Pasteurellamultocida toxin，PMT)。該毒素由toxA基因編碼，是產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌重要的毒力因子和保護(hù)性抗原。

2、為了分析和鑒定toxA基因中的毒力結(jié)構(gòu)域和免疫原性結(jié)構(gòu)域，本研究主要開展了以下幾方面的工作： 1.toxA基因及其截短片斷的克隆與表達(dá)：以本實(shí)驗(yàn)室分離保存的產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌HN-13株為研究對(duì)象。首先通過GenBank上已經(jīng)公布的各種不同株的多殺性巴氏桿菌的基因序列，進(jìn)行序列分析，找出其中比較保守的部位，分別設(shè)計(jì)了3對(duì)引物，以高保真DNA聚合酶用PCR方法分3段擴(kuò)增了toxA基因，連接酶連接，得到全長的toxA基因，共385

3、8bp。對(duì)獲得的全長toxA基因進(jìn)行基因測(cè)序，與GenBank上公布的登陸號(hào)為Z28388序列的核苷酸100％同源。然后根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，對(duì)全長toxA基因進(jìn)行分段截短或連接，共獲得9個(gè)大小不同的片段，并構(gòu)建了9個(gè)原核表達(dá)載體。將各個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE<,3>)感受態(tài)細(xì)胞，其中5個(gè)獲得了表達(dá)，對(duì)重組蛋白進(jìn)行了純化和Western-blot分析，結(jié)果表明：5種重組蛋白均能與HN-13株多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。

4、2.重組蛋白的免疫原性分析：將5種重組蛋白分別用弗氏佐劑乳化，分組免疫昆明小鼠，2周后加強(qiáng)免疫一次，免疫前后用PMT-ELISA檢測(cè)免疫組和對(duì)照組的抗體水平。二免后14天，以1個(gè)LD50的HN-13株進(jìn)行攻擊，統(tǒng)計(jì)各組小鼠在攻毒后24 h和48 h的存活率；取各組小鼠的肝臟和肺組織，進(jìn)行組織病理學(xué)分析。結(jié)果表明，重組蛋白的免疫保護(hù)性從C端截短片段到N端截短片段依次減弱，全長片段有良好的免疫保護(hù)力。 3.重組蛋白的細(xì)胞毒性分析：以

5、小鼠成纖維細(xì)胞(NIH-3T3細(xì)胞)為材料，實(shí)驗(yàn)評(píng)估了5種重組蛋白的細(xì)胞毒性，觀察細(xì)胞的死亡數(shù)量和病變狀況。結(jié)果表明，各重組蛋白的毒性較天然毒素有所降低，毒力從c端截短片段到N端截短片段依次減弱。 本課題對(duì)產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌toxA基因的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了研究。分段PCR擴(kuò)增并連接得到了toxA基因的全基因和缺失部分核苷酸的截短片段，分別研究了全基因與截短片段的免疫保護(hù)性和毒力，并開展了動(dòng)物試驗(yàn)和細(xì)胞毒力試驗(yàn)。試驗(yàn)表明，截短后的