豬產毒素多殺性巴氏桿菌toxA基因的功能結構域研究.pdf

1、產毒素多殺性巴氏桿菌(Toxigenic.Pasteurella multocida，T<'+>Pm)是豬進行性萎縮性鼻炎(Swine progressive atrophic rhinitis，PAR)的主要病原菌之一。它可以產生一種分子量為146kDa的慢性皮膚壞死性毒素——多殺性巴氏桿菌毒素(Pasteurellamultocida toxin，PMT)。該毒素由toxA基因編碼，是產毒素多殺性巴氏桿菌重要的毒力因子和保護性抗原。

2、為了分析和鑒定toxA基因中的毒力結構域和免疫原性結構域，本研究主要開展了以下幾方面的工作： 1.toxA基因及其截短片斷的克隆與表達：以本實驗室分離保存的產毒素多殺性巴氏桿菌HN-13株為研究對象。首先通過GenBank上已經公布的各種不同株的多殺性巴氏桿菌的基因序列，進行序列分析，找出其中比較保守的部位，分別設計了3對引物，以高保真DNA聚合酶用PCR方法分3段擴增了toxA基因，連接酶連接，得到全長的toxA基因，共385

3、8bp。對獲得的全長toxA基因進行基因測序，與GenBank上公布的登陸號為Z28388序列的核苷酸100％同源。然后根據(jù)相關文獻的報道，對全長toxA基因進行分段截短或連接，共獲得9個大小不同的片段，并構建了9個原核表達載體。將各個表達載體轉化大腸桿菌BL21(DE<,3>)感受態(tài)細胞，其中5個獲得了表達，對重組蛋白進行了純化和Western-blot分析，結果表明：5種重組蛋白均能與HN-13株多克隆抗體發(fā)生特異性反應。

4、2.重組蛋白的免疫原性分析：將5種重組蛋白分別用弗氏佐劑乳化，分組免疫昆明小鼠，2周后加強免疫一次，免疫前后用PMT-ELISA檢測免疫組和對照組的抗體水平。二免后14天，以1個LD50的HN-13株進行攻擊，統(tǒng)計各組小鼠在攻毒后24 h和48 h的存活率；取各組小鼠的肝臟和肺組織，進行組織病理學分析。結果表明，重組蛋白的免疫保護性從C端截短片段到N端截短片段依次減弱，全長片段有良好的免疫保護力。 3.重組蛋白的細胞毒性分析：以

5、小鼠成纖維細胞(NIH-3T3細胞)為材料，實驗評估了5種重組蛋白的細胞毒性，觀察細胞的死亡數(shù)量和病變狀況。結果表明，各重組蛋白的毒性較天然毒素有所降低，毒力從c端截短片段到N端截短片段依次減弱。 本課題對產毒素多殺性巴氏桿菌toxA基因的功能結構域進行了研究。分段PCR擴增并連接得到了toxA基因的全基因和缺失部分核苷酸的截短片段，分別研究了全基因與截短片段的免疫保護性和毒力，并開展了動物試驗和細胞毒力試驗。試驗表明，截短后的