多殺性巴氏桿菌HN06株新型免疫蛋白的鑒定及PGAM免疫功能研究.pdf

1、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）是一種廣泛流行于世界各地的病原菌，自然宿主十分廣泛。在豬群中能夠引起豬萎縮性鼻炎（Atrophic rhinitis，AR）和豬肺疫(Swine plague，SP)，在禽、牛、羊以及家兔等動(dòng)物中會(huì)引起出血性敗血癥(Haemorrhagic septicaemia,HS)，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前預(yù)防多殺性巴氏桿菌以免疫接種為主，疫苗類型主要分為以下幾種:強(qiáng)毒滅

2、活疫苗，弱毒活疫苗，亞單位疫苗。這些疫苗能在一定程度上對(duì)多殺性巴氏桿菌起到預(yù)防的作用，但是多殺性巴氏桿菌血清型很多，不同血清型菌株之間缺乏相互交叉的免疫保護(hù)，導(dǎo)致目前應(yīng)用的疫苗免疫效果不夠理想。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，利用病原菌的抗原蛋白制備的亞單位疫苗是當(dāng)前疫苗研究熱點(diǎn)，亞單位疫苗的理想抗原應(yīng)該具有:抗原性高，免疫原性強(qiáng)，安全性高等特點(diǎn)。以往理想抗原的篩選較為困難，隨著蛋白組學(xué)技術(shù):2-DE電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)的發(fā)展，尤其是結(jié)合免

3、疫印跡技術(shù)的免疫蛋白組學(xué)為篩選新型免疫保護(hù)性抗原，應(yīng)用于研制新型高效亞單位疫苗提供了重要途徑。蛋白組學(xué)技術(shù)的開發(fā)為尋找新型藥物靶點(diǎn)、亞單位疫苗、微生物毒力因子等提供了快速方便的手段。因此，我們針對(duì)具有代表性的產(chǎn)PMT毒素血清D型多殺性巴氏桿菌HN06株的細(xì)菌表面蛋白進(jìn)行免疫蛋白組學(xué)篩選，希望找到功能重要的免疫原性蛋白，為開發(fā)新型巴氏桿菌疫苗或研究其免疫機(jī)理作鋪墊，本研究主要結(jié)果如下:
　　1.HN06株表面免疫蛋白的篩選
　

4、　利用雙向電泳將提取的多殺性巴氏桿菌HN06株表面蛋白進(jìn)行分離，同時(shí)使用已制備好的感染血清、陰性對(duì)照血清與2-DE分離的表面蛋白進(jìn)行Western blot雜交，將篩選到的陽(yáng)性反應(yīng)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定。本研究質(zhì)譜分析共鑒定了4個(gè)新型免疫蛋白，分別為:三甲基胺-N-氧化還原酶(Trimethylamine-N-oxide reductase，TorA);延伸因子TS(Elongation factor Ts，EF-Ts);磷酸甘油變位酶(P

5、hosphoglyceromutase，PGAM);過氧化物酶(Peroxiredoxin，Prx)。這4個(gè)蛋白均是在巴氏桿菌免疫蛋白組學(xué)研究中首次被發(fā)現(xiàn)。
　　2.PGAM蛋白的表達(dá)與純化
　　PGAM為細(xì)菌產(chǎn)能代謝糖酵解關(guān)鍵酶，在細(xì)菌各種代謝途徑中通過調(diào)控丙酮酸的生成從而控制三羧酸循環(huán)(Tricarboxylic acid cycle，TCA)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)菌的生長(zhǎng)與繁殖。本研究利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)PGAM蛋白基因

6、gpmA與表達(dá)質(zhì)粒pET-30a進(jìn)行重組載體pET-30a-gpmA的構(gòu)建:再導(dǎo)入原核表達(dá)菌株BL21。原核大量表達(dá)后，利用鑷柱純化表達(dá)的目的蛋白。將純化后的蛋白與先前制備的感染血清進(jìn)行Western blot，檢測(cè)原核表達(dá)蛋白PGAM的生物活性，結(jié)果表明原核表達(dá)PGAM蛋白具有免疫活性。
　　3.PGAM的免疫性及功能研究
　　本研究通過PGAM蛋白對(duì)HN06株生長(zhǎng)狀況影響進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)PGAM蛋白能夠促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng);PG