A型肉毒毒素多表位串聯(lián)體的設(shè)計(jì)、表達(dá)及免疫原性分析.pdf

1、肉毒神經(jīng)毒素(BoNT)是自然界所發(fā)現(xiàn)的生物毒素(包括化學(xué)毒劑)中毒性最強(qiáng)的物質(zhì)。由于BoNT毒性強(qiáng)并且極容易被恐怖分子利用，國際社會(huì)已將其列為重要的毒素戰(zhàn)劑和最具威脅的生物恐怖劑之一。針對BoNT感染引起的肉毒中毒尚無較好的治療手段，到目前為止也沒有實(shí)用型的抗毒素問世，因而其疫苗的研究就顯得更為重要。雖然類毒素、特別是其重鏈重組亞單位疫苗具有很好的保護(hù)作用，但均存在著不可忽視的潛在的副作用。多表位疫苗的提出為BoNT疫苗的研發(fā)提供了新

2、思路，一方面多表位疫苗能夠集中優(yōu)勢的中和表位，去除對保護(hù)性免疫不利的結(jié)構(gòu)或潛在的毒性片段；另一方面能優(yōu)化組合BoNT各種型別的中和性表位，為研制多價(jià)疫苗奠定基礎(chǔ)，以解決目前國際上多以單一型別BoNT為主研究重組基因工程疫苗的弊端。因此開展BoNT多表位疫苗的探索性研究具有十分重要的醫(yī)學(xué)和社會(huì)意義。 首先，本研究基于保守性高的BoNT/A的氨基酸序列，根據(jù)BioSun和LaserGene軟件包中的表位分析相關(guān)參數(shù)，輔以對BoNT/

3、A蛋白的二級結(jié)構(gòu)的分析，綜合預(yù)測了BoNT/A的B細(xì)胞表位。結(jié)果表明，BoNT/A輕鏈的142-150、284-292區(qū)段，重鏈的440-450、465-480、538．549、699-710、751-760、1087-1095、1224-1231、1263-1270區(qū)段是B細(xì)胞優(yōu)勢表位區(qū)的可能性較大。 然后，遴選預(yù)測得到的B細(xì)胞表位和文獻(xiàn)報(bào)道的表位，并加入適當(dāng)?shù)妮o助性元件：通用T細(xì)胞表位和Linker，設(shè)計(jì)了多表位串聯(lián)體A、B

4、。根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性對其基因進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，經(jīng)重疊PCR方法合成串聯(lián)體A、B的基因全長。并構(gòu)建了克隆測序質(zhì)粒pMD18-T-A、pMD18-T-B進(jìn)行序列分析鑒定，結(jié)果表明，重疊PCR合成的基因序列均與密碼子優(yōu)化后的基因序列完全一致。然后用BamHⅠ、HindⅢ分別雙酶切pMD18-T-A、pMD18-T-B載體和表達(dá)載體pQE-30，并連接獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pQE-30A，pQE-30B。經(jīng)過雙酶切和PCR鑒定正確后，轉(zhuǎn)化到Ec

5、oli M15[pREP4]感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)工程菌。用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這兩種重組蛋白都以包涵體形式存在，表達(dá)量分別達(dá)到全菌蛋白的70％、54％。SDS-PAGE分析顯示，與預(yù)期蛋白的大小相符，預(yù)期蛋白的分子量分別為22.4×10<'3>、24.9×10<'3>。Western印跡和間接ELISA結(jié)果顯示重組蛋白串聯(lián)體A、B均可被其特異性馬血清抗毒素識別，進(jìn)一步驗(yàn)證了串聯(lián)體A、B基因在工程菌中獲得正確表達(dá)，并具有良好

6、的抗原性。Ni-NTA法純化后分別獲得純度大于92.2％、99％的重組串聯(lián)體A、B蛋白，然后采用透析復(fù)性法對其進(jìn)行復(fù)性。接著，將串聯(lián)體A、B分別與等體積的弗氏佐劑混合后免疫Balb/C小鼠，20μg/只，采用背部皮下多點(diǎn)注射的免疫途經(jīng)。并以PBS作為對照。四免后血清效價(jià)達(dá)到10<'3>～10<'4>，說明設(shè)計(jì)表達(dá)的重組蛋白具有一定的免疫原性。四次免疫后一周，以2、5、10、20、40×LD<,50> BoNT/A腹腔攻擊小鼠，觀察小鼠存

7、活天數(shù)。動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，免疫組小鼠未表現(xiàn)出比對照組小鼠更好的抵抗天然毒素攻擊的能力，并且ELISA及Western印跡試驗(yàn)表明，其免疫小鼠血清不能結(jié)合天然的BoNT/A。 針對上述試驗(yàn)結(jié)果，在串聯(lián)體A的基礎(chǔ)上調(diào)整了設(shè)計(jì)方案，重新優(yōu)化構(gòu)建了三個(gè)串聯(lián)體：串聯(lián)體A'、C以及合成的表位串聯(lián)體肽(串聯(lián)體肽)。其中，串聯(lián)體A'是用8M脲直接溶解串聯(lián)體A重組蛋白的包涵體得到，即純化后未經(jīng)復(fù)性的串聯(lián)體A；串聯(lián)體C則是將串聯(lián)體A的Th表位由C

8、端移至N端。串聯(lián)體肽是由文獻(xiàn)報(bào)道的兩個(gè)中和表位通過GGS相連構(gòu)成。 以串聯(lián)體A'，C和串聯(lián)體肽免疫Balb/C小鼠。攻毒試驗(yàn)表明新構(gòu)建的三個(gè)串聯(lián)體可以抵抗3×LD<,50>天然BoNT/A的攻擊。該保護(hù)作用還不及文獻(xiàn)報(bào)道的單個(gè)表位合成肽免疫效果，據(jù)此推測串聯(lián)體A、B無保護(hù)作用的主要原因可能是選用的LinkerGGS沒有起到有效的分隔作用。同時(shí)認(rèn)為Th的位置對表位設(shè)計(jì)影響不大。本研究雖然未能獲得具有良好保護(hù)性的串聯(lián)體，但發(fā)現(xiàn)了一些