鴨疫里默氏桿菌的液體培養(yǎng)技術(shù)及免疫原性研究.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌病(Riemerella anatipestifer infection)是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的幼鴨急性或慢性敗血性傳染病,又稱鴨傳染性漿膜炎,是嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的傳染病之一。該病的發(fā)病率可達(dá)90％以上,死亡率一般在5％～75％之間,除可引起1～8周齡鴨死亡外,還可引起輸卵管炎,造成成年鴨產(chǎn)蛋率下降,耐過鴨多成僵鴨,生長遲緩,給養(yǎng)殖戶造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。藥物是預(yù)防

2、和治療該病的主要措施,但反復(fù)用藥增加了飼養(yǎng)成本,且易產(chǎn)生耐藥性,導(dǎo)致藥物殘留超標(biāo),危害食品安全,所以對(duì)雛鴨進(jìn)行免疫接種成為控制該病的一種發(fā)展方向。近些年來,國內(nèi)外學(xué)者都致力于RA疫苗的研究。 由于RA血清型復(fù)雜,各血清型之間缺乏交叉保護(hù),所以選擇發(fā)病地區(qū)鴨場流行的優(yōu)勢血清型制備疫苗成為疫苗研制的關(guān)鍵。而制苗用菌株大批量、高質(zhì)量的增菌培養(yǎng)又成為降低疫苗生產(chǎn)成本,提高疫苗免疫效果的另一關(guān)鍵。 本研究通過對(duì)鴨疫里默氏桿菌GN5

3、2株(血清10型)進(jìn)行液體培養(yǎng)和免疫原性研究,確定了鴨疫里默氏桿菌適宜的增菌培養(yǎng)基,建立了高密度發(fā)酵RA的液體培養(yǎng)技術(shù),確定了鴨疫里默氏桿菌病滅活疫苗的生產(chǎn)工藝規(guī)程。 本研究通過對(duì)比試驗(yàn)確定了一種增菌效果較好的培養(yǎng)基。在前期流行病學(xué)調(diào)查的基礎(chǔ)上,采用從發(fā)病地區(qū)分離的優(yōu)勢血清型10型菌株(RAGN52株)分別用改良馬丁肉湯、改良酵母肉湯和P-L肉湯三種液體培養(yǎng)基進(jìn)行增菌培養(yǎng),比較其增菌效果。結(jié)果表明,改良酵母肉湯的增菌效果比改良馬

4、丁肉湯和P-L肉湯的好,測定細(xì)菌的生長曲線,RA GN52株在改良酵母肉湯中培養(yǎng)24h達(dá)生長高峰,菌液含量可達(dá)270×108～320×108CFU/ml。 本研究建立了高密度發(fā)酵RA的液體培養(yǎng)技術(shù)。利用液體發(fā)酵裝置對(duì)RA進(jìn)行增菌培養(yǎng),通過染色鏡檢、活菌計(jì)數(shù)、OD450值測定、PH值測定等方法對(duì)RA的生長曲線進(jìn)行摸索,確定培養(yǎng)方法、最佳收菌時(shí)間及最佳滅活條件。結(jié)果表明,RA在培養(yǎng)過程中,菌液PH值基本不變；37℃液體發(fā)酵培養(yǎng)20h

5、活菌含量最高,可達(dá)320～350億CFU/ml;0.3％甲醛37℃滅活18h為最佳；OD450值與活菌數(shù)之間存在一定的函數(shù)關(guān)系,可通過測定RA菌液的OD450值推算其活菌數(shù)。本研究研制了產(chǎn)生抗體快,保護(hù)率高,免疫持續(xù)時(shí)間長,保存期長的鴨疫里默氏桿菌病滅活疫苗。RA GN52株經(jīng)改進(jìn)的液體培養(yǎng)工藝進(jìn)行增菌后,制備油乳劑滅活疫苗,經(jīng)無菌和安全檢驗(yàn)合格后,進(jìn)行免疫原性研究。結(jié)果表明,對(duì)3日齡雛鴨頸部皮下注射0.3ml/羽即可產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答