斑馬魚虹彩病毒感染模型的建立及免疫相關分子研究.pdf

1、本論文借助一系列的實驗動物學，免疫學，病理學，生物化學和分子生物學等方法成功建立斑馬魚-ISKNV感染模型，并通過差減文庫的方法找到一系列的免疫，病理相關基因，為揭示低等生物抗病毒免疫機制的研究奠定基礎和提供必要的平臺。同時作為低等生物的代表，本論文還就斑馬魚中LPS耐受問題及LPS識別分子TLR4功能進行了初步驗證。 1，本論文成功的建立斑馬魚-傳染性脾臟腎臟壞死病病毒(infectious spleenand kidney

2、necrosis virus，ISKNV)感染模型，并進行一系列的鑒定工作。發(fā)現(xiàn)斑馬魚感染ISKNV后出現(xiàn)以全身性出血，豎鱗及脾臟腫大為特征的典型的臨床癥狀，病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)明顯的貧血癥狀。免疫組織化學及免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)病毒能夠感染斑馬魚多個組織器官，但病毒信號并不位于組織特異性細胞，提示病毒宿主細胞可能為問質細胞。同時比較發(fā)現(xiàn)感染斑馬魚自身不同組織內病毒表現(xiàn)有所不同，具體為病毒感染能力的相似性及病毒增殖能力的差異，與感染鱖魚比較發(fā)現(xiàn)

3、感染斑馬魚中病毒沒有表現(xiàn)任何形式的細胞外釋放，而在感染鱖魚中則完全相反病毒大部分已釋放到感染細胞外，病毒在斑馬魚傳代過程中，這種釋放抑制的情況有所改觀；流式細胞及real—time RT-PCR檢測顯示斑馬魚淋巴細胞有所增加，經(jīng)典的免疫相關分子幾乎沒有任何變化，提示斑馬魚可能采取不同的策略清除病毒。 2，成功建立斑馬魚不同病毒來源，不同組織，不同感染時間的5個差減cDNA文庫，排查出大量免疫相關，病理相關的基因，揭示病毒感染后

4、斑馬魚免疫學，病理學的變化，推測其可能采取的免疫學機制。具體基因主要分三個部分，一是免疫相關基因，二是凋亡相關基因，三是腫瘤相關基因，發(fā)現(xiàn)斑馬魚-ISKNV中可能通過NF-?B活性抑制從而抑制經(jīng)典抗病毒分子的表達，在斑馬魚-ISKNV中發(fā)現(xiàn)大量持續(xù)表達的急性期反應蛋白和凝集素分子，同時也發(fā)現(xiàn)體液免疫分子lg及細胞免疫效應分子穿孔素的上調，免疫信號通路分子MAPK及ERK分子；凋亡相關基因相關基因主要為細胞色素C氧化酶，easpase a

5、及caspase 8等并通過實驗方法驗證在斑馬魚感染ISKNV后大量凋亡現(xiàn)象的出現(xiàn)。腫瘤相關基因主要為Ras原癌基因家族，可能參與Ras-MAPK-ERK．通路激活。 3，對低等生物LPS不敏感問題進行初步探討，發(fā)現(xiàn)斑馬魚面對高劑量LPS刺激同樣表現(xiàn)為耐受，斑馬魚LPS受體分子TLR4主要在血液中表達，并且LPS能夠引起其上調表達，同時還發(fā)現(xiàn)斑馬魚TLR4a，TLR4b不同細菌來源LPS的反應性有所不同，與其他生物TLR4基因進