乙型肝炎病毒感染小鼠模型的建立.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染是全球范圍影響健康的重要問題，慢性感染人群存在肝硬化和肝細(xì)胞癌的高患病風(fēng)險(xiǎn)。盡管乙型肝炎病毒疫苗有效，但是在世界范圍內(nèi)慢性感染人數(shù)超過了3.5億，占全球人數(shù)的5％。HBV感染具有宿主特異性，在自然情況下，HBV不感染醫(yī)學(xué)研究中常用的實(shí)驗(yàn)小動物。乙型肝炎病毒生物學(xué)研究未完全闡明，缺乏理想的小動物模型給疾病的治療和研究帶來困難。 針對上述問題確立本課題的研究目的：基于水動

2、力轉(zhuǎn)染技術(shù)和/或噬菌體整合酶系統(tǒng)，建立HBV急性感染小鼠模型和HBV小鼠體內(nèi)長期表達(dá)模型，用于HBV致病機(jī)制研究以及抗HBV藥物在體內(nèi)篩選與評價(jià)。具體研究內(nèi)容如下： 1．真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 以真核表達(dá)載體pCI-neo為構(gòu)架，將1.3倍長HBV全基因組連接在不同真核表達(dá)載體中，構(gòu)建HBV全基因組重組質(zhì)粒pCI-neo-AerApoEAATP-HBV1.3和pCI-neo-CMV-HBV1.3。 2．急性HB

3、V感染小鼠模型的建立 水動力轉(zhuǎn)染方法將HBV表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Balb/c小鼠(免疫系統(tǒng)正常小鼠)和Balb/c裸鼠(免疫系統(tǒng)缺陷小鼠)體內(nèi)，觀察HBV在小鼠體內(nèi)復(fù)制和表達(dá)情況。 結(jié)果表明，HBV在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)病毒mRNA。通過免疫組織化學(xué)和血清ELISA方法，分析HBV在小鼠模型中的表達(dá)和分泌特征。小鼠肝細(xì)胞中表達(dá)的病毒蛋白可分泌入血，急性期第3天Balb/c小鼠血清中HBsAg檢出率為100％，但HBsAg的存在時(shí)間

4、和水平并不相同，具有較明顯的個(gè)體差異，持續(xù)表達(dá)時(shí)間約為7天，同時(shí)在兩周后檢測到抗-HBs；Balb/c裸鼠血清中HBsAg持續(xù)陽性約為30天。采用血清real-time PCR的方法，分析了急性感染小鼠體內(nèi)HBV的復(fù)制和分泌特征。小鼠血清中存在HBV DNA，在急性期其含量明顯高于臨床患者陽性標(biāo)準(zhǔn)(≥10<'3>copies/ml)，在第3天最高可達(dá)到10<'7>copies/ml。Balb/c小鼠體內(nèi)HBV DNA在30天后降至陽性臨

5、界值以下，Balb/c裸鼠可以維持45天左右。血清中HBV DNA的定量檢測簡便準(zhǔn)確，是用于評價(jià)抗病毒藥物治療效果的重要指標(biāo)之一。無論是HBV感染Balb/c小鼠還是Balb/c裸鼠，HBV在小鼠體內(nèi)皆為瞬時(shí)表達(dá)，表達(dá)時(shí)間比較短。在此基礎(chǔ)上為了延長HBV在小鼠體內(nèi)的表達(dá)時(shí)間，本課題提出水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)結(jié)合噬菌體整合酶系統(tǒng)建立長期表達(dá)HBV小鼠模型的設(shè)想。 3．HBV小鼠體內(nèi)長期表達(dá)模型的建立 噬菌體φC31整合酶能識別噬菌

6、體的attP位點(diǎn)和宿主基因組上的attB位點(diǎn)，由于attP位點(diǎn)和attB位點(diǎn)是同源序列，通過整合酶介導(dǎo)同源序列之間的位點(diǎn)特異性重組，從而將噬菌體基因組整合到細(xì)菌染色體上。最近研究發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟細(xì)胞染色體上存在兩個(gè)被噬菌體整合酶識別的attP同源序列mpsL1和mpsL2，因此可通過在目的基因表達(dá)框架上添加整合酶作用靶序列attB位點(diǎn)，在整合酶作用下，使外源基因在小鼠體細(xì)胞基因組特異位點(diǎn)進(jìn)行整合，實(shí)現(xiàn)目的基因在小鼠體細(xì)胞內(nèi)長期穩(wěn)定表達(dá)。

7、 在己構(gòu)建的含HBV1.3基因組的質(zhì)粒啟動子前分別插入噬菌體整合酶識別位點(diǎn)attB，得到含整合酶識別位點(diǎn)attB的質(zhì)粒pCI-neo-attB-AerApoEAATP-HBV1.3和pCI-neo-attB-CMV-HBV1.3應(yīng)用水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)分別將此載體與整合酶表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Int共轉(zhuǎn)染Balb/c小鼠肝臟，觀察HBV在小鼠體內(nèi)肝臟表達(dá)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。 結(jié)果表明，HBV在小鼠肝臟中轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)病毒mRNA。轉(zhuǎn)染45天后

8、小鼠肝細(xì)胞中仍表達(dá)HBcAg病毒蛋白，同時(shí)小鼠肝細(xì)胞中表達(dá)的病毒蛋白可分泌入血，HBsAg表達(dá)時(shí)間比急性感染小鼠模型明顯延長，第30天仍持續(xù)陽性。血清real-time PCR的方法，分析了小鼠血清中存在的HBV DNA，其含量(10<'7>copies/ml)明顯高于臨床患者陽性標(biāo)準(zhǔn)，在血清中的存在時(shí)間明顯長于急性感染小鼠模型，在轉(zhuǎn)染后100天時(shí)仍然在臨床規(guī)定的陽性水平之上。 由于HBV在該小鼠模型體內(nèi)表達(dá)時(shí)間較急性感染組明顯

9、延長，所以對噬菌體整合酶在小鼠體內(nèi)的作用進(jìn)行了鑒定。 針對小鼠染色體上特異性整合位點(diǎn)中熱點(diǎn)-mpsL<,1>設(shè)計(jì)引物，利用巢式PCR鑒定目的基因在小鼠染色體上的整合位點(diǎn)，PCR鑒定和測序結(jié)果正確；同時(shí)也鑒定出了HBV在體內(nèi)的中間復(fù)制模板cccDNA，證明HBV表達(dá)質(zhì)粒通過特異性位點(diǎn)已經(jīng)整合到小鼠染色體上，并能在小鼠體內(nèi)復(fù)制。 選用臨床上常用的兩種抗病毒藥物恩替卡韋和拉米夫定對該模型用于抗HBV藥物的篩選和評價(jià)的可行性進(jìn)行了初步