JC病毒感染診斷方法的建立.pdf

1、目的：構(gòu)建JC病毒衣殼蛋白VP1基因的原核表達(dá)載體，在大腸埃希菌中誘導(dǎo)表達(dá)并純化該蛋白。制備JC病毒小t抗原單克隆抗體，初步鑒定單克隆抗體的特性。通過上述抗原抗體的制備為JC病毒血清學(xué)診斷方法的建立打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。建立可靠的巢式PCR方法，并用該方法對(duì)60例慢乙肝患者JC病毒感染狀況進(jìn)行調(diào)查。 方法： 1．用PCR方法擴(kuò)增患者尿液中JC病毒衣殼蛋白VP1的基因，測序正確后將其克隆入pET-32a(+)原核表達(dá)載體，IPT

2、G(異丙基—β—D毓代半乳糖苷)誘導(dǎo)表達(dá)VP1融合蛋白。大量表達(dá)該融合蛋白并用鎳柱親和層析法純化。 2．用純化的小t重組蛋白免疫BALB/c小鼠。免疫結(jié)束后，取其脾臟制備脾細(xì)胞懸液。將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按照5：1的比例在PEG作用下融合。融合細(xì)胞用HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤與胸苷)選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)3次有限稀進(jìn)行克隆化，用間接ELISA法篩選陽性單克隆。將陽性單克隆接種至小鼠腹腔，收集腹水。單抗亞型采用雙抗體夾心法檢測，特異性用

3、Westernblot檢測。 3．根據(jù)序列同源比對(duì)結(jié)果，在JCV基因組中選取保守區(qū)設(shè)計(jì)巢式PCR引物進(jìn)行反應(yīng)，驗(yàn)證其特異度和靈敏度滿足檢驗(yàn)要求后，利用該方法對(duì)60例慢乙肝患者尿液標(biāo)本進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果與40例健康志愿者檢測結(jié)果進(jìn)行比較，分析慢乙肝患者JC病毒感染狀況與健康人群之間的差異。 結(jié)果： 1．成功構(gòu)建重組表達(dá)載體，30℃，IPTG誘導(dǎo)可見有融合蛋白表達(dá)，存在形式為包涵體。該融合蛋白分子量約為59KD。We

4、sternblot證明融合蛋白具有很好的抗原性。用鎳柱親和層析法成功純化出VP1融合蛋白。 2．篩選出能穩(wěn)定分泌小t抗原單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞1株。間接ELISA法檢測腹水單抗效價(jià)在1：8000左右。Westernblot檢測抗體特異性好。進(jìn)一步檢測其亞型不純。 3．建立了穩(wěn)定檢測JCVDNA的巢式PCR方法，該方法檢測尿液中JC病毒的靈敏度為1.2×103copy/ml，特異度大于98％；慢乙肝患者組JCVDNA的檢出

5、率為83％(50/60)，顯著高于健康志愿的45％(18/40)(P＜0.005)。 結(jié)論： 1．成功表達(dá)VP1融合蛋白，為進(jìn)一步研究JC病毒血清學(xué)診斷方法奠定了基礎(chǔ)。 2．初步獲得JC病毒單克隆抗體，為小t抗原功能的研究以及JC病毒血清學(xué)檢測方法的建立打下良好基礎(chǔ)。 3．巢氏PCR方法臨床檢測JCVDNA重復(fù)性及穩(wěn)定性好，特異性及靈敏度高，簡便易行；慢乙肝患者JC病毒感染率顯著高于健康人群，應(yīng)引起重視。