呼吸道病毒高通量懸浮芯片檢測(cè)方法的建立及新現(xiàn)呼吸道病毒的分子特征分析.pdf

1、第一部分、呼吸道病毒高通量懸浮芯片檢測(cè)方法的建立
　　 目的：建立常見(jiàn)呼吸道病毒的懸浮芯片檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)呼吸道病毒的快速、高通量檢測(cè)。
　　 方法：
　　 (1)建立兩組懸浮芯片檢測(cè)方法，1組為流感病毒懸浮芯片檢測(cè)方法，用于流感病毒型/亞型檢測(cè)，包括季節(jié)性H1、季節(jié)性H3、新現(xiàn)的新甲型H1N1、高致病性禽流感H5及B型流感病毒；2組為常見(jiàn)呼吸道病毒懸浮芯片檢測(cè)方法，檢測(cè)15種常見(jiàn)呼吸道病毒，其中包括A、B型流感病

2、毒(FluA、FluB)及新現(xiàn)的呼吸道病毒人博卡病毒(HBoV)、人偏肺病毒(HMPV)、WU多瘤病毒(WUPyV)、NL63型冠狀病毒(Cov NL63)和HKU1型冠狀病毒(Cov HKU1)。
　　 (2)引物和探針設(shè)計(jì)：流感病毒懸浮芯片檢測(cè)方法(1組)引物和探針參照WHO推薦序列合成。常見(jiàn)呼吸道病毒懸浮芯片檢測(cè)方法(2組)病毒的引物和探針設(shè)計(jì)如下：從GenBank下載不同呼吸道病毒的基因序列，用ClustalX進(jìn)行序列比

3、對(duì)后，找到每種病毒的基因保守序列，用Primier5.0和Oligo6.0軟件在保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針，盡量使不同病毒引物Tm值接近，引物擴(kuò)增的目的片段大小在100bp-300bp之間。同時(shí)采用Oligo6.0軟件對(duì)設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行引物二級(jí)結(jié)構(gòu)及互相之間形成引物二聚體的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，根據(jù)評(píng)價(jià)結(jié)果將15對(duì)呼吸道病毒引物分為兩個(gè)pool，用于多重PCR擴(kuò)增。對(duì)探針序列進(jìn)行blast比對(duì)，評(píng)價(jià)其特異性。
　　 (3)探針與微球耦聯(lián)：按照

4、微球供應(yīng)商提供的方法進(jìn)行探針與微球的耦聯(lián)，并用倍比稀釋的與探針互補(bǔ)的validation oligo進(jìn)行耦聯(lián)效果評(píng)價(jià)。1組用與季節(jié)性H1、H3、新甲型H1N1及B型流感病毒探針互補(bǔ)的validation oligo進(jìn)行了耦聯(lián)效果評(píng)價(jià)，2組用與OC43型冠狀病毒(Cov OC43)、HMPV、FluA及FluB探針互補(bǔ)的validation oligo進(jìn)行了耦聯(lián)效果評(píng)價(jià)。
　　 (4)多重PCR擴(kuò)增及雜交條件優(yōu)化：1組為5重PCR

5、擴(kuò)增，2組分為兩個(gè)pool，1個(gè)為7重PCR擴(kuò)增，另1個(gè)為8重PCR擴(kuò)增。通過(guò)不同退火溫度及引物濃度組合，優(yōu)化反應(yīng)條件及引物濃度。優(yōu)化多重PCR反應(yīng)條件后，在不同溫度下將PCR產(chǎn)物與耦聯(lián)有探針的微球進(jìn)行雜交，用Bio-Plex200檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化雜交溫度。標(biāo)本熒光強(qiáng)度值(MFI)=陰性對(duì)照標(biāo)本5倍判斷為陽(yáng)性。
　　 (5)用本實(shí)驗(yàn)室保存的不同型/亞型的流感病毒毒株(H5亞型除外)按TCID50(半數(shù)組織細(xì)胞感染量)倍比稀釋

6、后進(jìn)行1組懸浮芯片檢測(cè)，評(píng)價(jià)敏感性和特異性。對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的14種常見(jiàn)呼吸道病毒(副流感病毒2型(PIV2)除外)陽(yáng)性標(biāo)本及滅活H5亞型流感病毒培養(yǎng)液進(jìn)行RT-PCR/PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化、定量后，10倍系列稀釋核酸進(jìn)行2組懸浮芯片檢測(cè)(H5亞型純化產(chǎn)物稀釋液進(jìn)行1組懸浮芯片檢測(cè))，評(píng)價(jià)所建立方法的敏感性和特異性。
　　 (6)臨床標(biāo)本驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：按照以上建立的方法，對(duì)2009年1月采集的8份及2010年2月采集的100份流

7、感樣病例(ILI)的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行1組懸浮芯片檢測(cè)，并與WHO推薦的Real-time PCR方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。對(duì)2008年9月～2009年12月采集的88份下呼吸道感染患者的鼻咽吸取物(NPA)標(biāo)本進(jìn)行2組懸浮芯片檢測(cè)，并與單引物PCR(檢測(cè)HBoV及WUPyV)和多重PCR試劑盒(Seegeen，韓國(guó))檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：
　　 (1)單引物PCR驗(yàn)證引物：用設(shè)計(jì)的不同呼吸道病毒特異的引物對(duì)已知呼吸道

8、病毒陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行單引物PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增出目的條帶，說(shuō)明設(shè)計(jì)的引物可用于后續(xù)多重PCR方法建立。
　　 (2)探針與微球耦聯(lián)：不同稀釋度vallidation olligo與微球雜交后MFI值均與vallidation olligo的稀釋倍數(shù)成正比，最高稀釋度的vallidation olligo與微球雜交后MFI值也在700以上，說(shuō)明探針與微球耦聯(lián)成功。
　　 (3)多重PCR擴(kuò)增條件及雜交溫度優(yōu)化：用不同型/亞型流

9、感病毒和已知病毒陽(yáng)性的標(biāo)本核酸進(jìn)行梯度多重PCR擴(kuò)增，1組和2組多重PCR的最佳退火溫度分別為60℃和62℃。通過(guò)不同引物濃度組合比較，確定了多重PCR的最佳引物濃度。1組和2組懸浮芯片檢測(cè)方法的最佳雜交溫度分別為54℃和50℃。
　　 (4)敏感性：1組懸浮芯片檢測(cè)方法的敏感性為季節(jié)性H1N1亞型5TCID50/mL、季節(jié)性H3N2亞型0.05 TCID50/mL、新甲型H1N10.05 TCID50/mL、B型5 TCID5

10、0/mL及H5亞型10-8ng/μL；2組懸浮芯片檢測(cè)方法的敏感性為HMPV10-8ng/μL、HBoV10-8ng/μL、WUPyV10-8ng/μL、Adv(腺病毒)10-8ng/μL、Cov OC4310-8ng/μL、Cov229E(229E型冠狀病毒)10-7ng/μL、Cov NL6310-8ng/μL、Coy HKU110-8ng/μL、PIV1(副流感病毒1型)10-9ng/μL、PIV3(副流感病毒3型)10-9ng/

11、μL、HRV(鼻病毒)10-7ng/μL、RSV(呼吸道合胞病毒)10-8ng/μL、FluA10-9ng/μL、FluB10-8ng/μL。
　　 (5)特異性：用1組和2組懸浮芯片方法檢測(cè)不同型/亞型流感病毒或不同種類呼吸道病毒，病毒之間均無(wú)交叉反應(yīng)。
　　 (6)108份咽拭子標(biāo)本進(jìn)行1組懸浮芯片檢測(cè)，結(jié)果與Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致，符合率100％。88份NPA標(biāo)本進(jìn)行2組懸浮芯片檢測(cè)，與多重PC

12、R試劑盒(Seegeen)及單引物PCR結(jié)果進(jìn)行比較，2組懸浮芯片方法檢測(cè)不同呼吸道病毒的靈敏度為50.0％～100.0％，特異度為96.4％～100.0％，陽(yáng)性預(yù)期值為33.3％～100.0％，陰性預(yù)期值為94.8％～100.0％，符合率為93.2％～100％。
　　 結(jié)論：本文成功建立了包括新現(xiàn)呼吸道病毒(新甲型H1N1流感病毒、HMPV、HBoV、WUPyV、Cov NL63及Coy HKU1)在內(nèi)的流感病毒和常見(jiàn)呼吸道病

13、毒懸浮芯片檢測(cè)方法，并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳實(shí)驗(yàn)方案。該方法的敏感性、特異性均較好，檢測(cè)時(shí)限為6h，同時(shí)可檢測(cè)15種常見(jiàn)呼吸道病毒及5種型/亞型流感病毒。
　　 第二部分、新現(xiàn)呼吸道病毒的分子特征分析
　　 目的：研究新現(xiàn)呼吸道病毒新甲型H1N1流感病毒、HMPV、HBoV及WUPyV的感染狀況及病毒相關(guān)基因特性。
　　 方法：
　　 (1)用病毒分離或Real-time PCR法，對(duì)2009年

14、4月～2011年3月采集的ILI咽拭子標(biāo)本和重癥呼吸道感染患者的NPA、鼻咽拭子及氣管盥洗液等呼吸道標(biāo)本進(jìn)行包括新現(xiàn)甲型H1N1在內(nèi)的流感病毒檢測(cè)。并對(duì)分離自上述病例中重癥/死亡病例的14株新甲型H1N1流感病毒毒株進(jìn)行HA基因序列測(cè)定，其中6株進(jìn)行NA基因序列測(cè)定，3株進(jìn)行全基因組序列測(cè)定，分析序列特征，繪制種系發(fā)生樹(shù)。
　　 (2)采集2006年和2008年春季、2008年和2009年秋冬季的急性呼吸道感染住院兒童的310份

15、NPA標(biāo)本，進(jìn)行巢式RT-PCR擴(kuò)增HMPVN和F基因片段，RT-PCR擴(kuò)增G基因，并對(duì)擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，繪制種系發(fā)生樹(shù)。同時(shí)收集所有陽(yáng)性患者的臨床資料。并采用PCR和多重PCR對(duì)HMPVN基因陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行其他呼吸道病毒檢測(cè)。HMPV檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本同時(shí)用Vero-E6和LLC-MK2細(xì)胞進(jìn)行病毒分離。
　　 (3)采集2008年春季、2008年秋冬季和2009年冬春季的急性下呼吸道感染住院兒童的238份NPA標(biāo)本，采用PC

16、R檢測(cè)HBoV NP-1基因片段，并對(duì)VP1/VP2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析，繪制種系發(fā)生樹(shù)。同時(shí)采用PCR和多重PCR檢測(cè)其它呼吸道病毒。
　　 (4)采集2008年春季、2008年秋冬季和2009年冬春季的急性下呼吸道感染住院兒童的NPA標(biāo)本238份，2009年冬季的急性上呼吸道感染的咽拭子標(biāo)本68份以及2009年2月～11月對(duì)照組咽拭子標(biāo)本43份，進(jìn)行WUPyV VP2基因片段PCR擴(kuò)增，同時(shí)對(duì)擴(kuò)增陽(yáng)性標(biāo)本采用PCR和

17、多重PCR檢測(cè)其他呼吸道病毒。
　　 結(jié)果：
　　 (1)流感病毒2009年4月～2011年3月共檢測(cè)呼吸道標(biāo)本7931份(其中ILI咽拭子標(biāo)本6177份，重癥呼吸道感染病例呼吸道標(biāo)本754份)，1567份(19.8％)檢出流感病毒。2009年4月～2009年9月、2009年10月～2010年3月、2010年4月～2010年9月和2010年10月～2011年3月四個(gè)監(jiān)測(cè)季流感病毒優(yōu)勢(shì)流行亞型分別為季節(jié)性H3(60.8％，

18、185/304)、新甲型H1N1(76.8％，630/820)、季節(jié)性H3(77.6％，118/152)和新甲型H1N1(51.5％，150/291)。四個(gè)監(jiān)測(cè)季中季節(jié)性H3亞型流感病毒HA基因變異較小，屬抗原漂移。
　　 (2)新甲型H1N1流感病毒：
　　 1567份流感病毒陽(yáng)性標(biāo)本中，56.3％(882/1567)為新甲型H1N1流感病毒。25.5％(192/754)的重癥呼吸道感染病例為新甲型H1N1流感病毒陽(yáng)性

19、。不同監(jiān)測(cè)季新甲型H1N1流感病毒在所有流感病毒中的構(gòu)成比如下：2009年4月～2009年9月為33.6％(102/304)，2009年10月～2010年3月為76.8％(630/820)，2010年4月～2010年9月為0.6％(1/152)，2010年10月～2011年3月為51.5％(150/291)。新甲型H1N1流感病毒為2009年10月～2010年3月和2010年10月～2011年3月兩個(gè)監(jiān)測(cè)季的優(yōu)勢(shì)流行亞型。種系發(fā)生分析顯

20、示，新甲型H1N1流感病毒的HA、NA、M、NP和NS基因來(lái)源于豬流感病毒，PB2和PA基因來(lái)源于禽流感病毒，PB1基因來(lái)源于人流感病毒。天津地區(qū)新甲型H1N1流感病毒8個(gè)片段與WHO推薦的疫苗株A/California/07/2009(H1N1)及中國(guó)的代表株A/Sichuan/1/2009(H1N1)相比，同源性很高，為98.2％-99.5％。HA基因氨基酸序列與疫苗株比較，未發(fā)現(xiàn)受體結(jié)合位點(diǎn)變異。NA基因氨基酸序列分析顯示，天津地

21、區(qū)新甲型H1N1流感病毒對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑(如達(dá)菲)敏感。
　　 (3)HMPV310份NPA標(biāo)本中共檢出20份(6.5％)HMPV。HMPV陽(yáng)性患兒的臨床診斷均為支氣管肺炎，其臨床癥狀以咳嗽、喘息、呼吸急促、發(fā)燒等常見(jiàn)。HMPV陽(yáng)性患兒的年齡中位數(shù)為15.0個(gè)月(16d-9歲)，其中=2歲患兒占90.0％(18/20)。男性占60.0％(12/20)。17株HMPVN基因和18株HMPVF基因種系發(fā)生樹(shù)分析顯示，14株為A型(

22、其中13株為A2b亞型)，6株為B型。A、B型間臨床特征未見(jiàn)明顯差別。G基因變異最大，N和F基因片段相對(duì)保守。2例HMPV陽(yáng)性患兒分別與腺病毒和鼻病毒混合感染。HMPV的細(xì)胞分離較困難，用 Vero-6細(xì)胞從PCR陽(yáng)性標(biāo)本中成功分離到HMPV，Vero-E6分離HMPV優(yōu)于LLC-MK2。
　　 (4)HBoV238份NPA標(biāo)本中，17份(7.1％)為HBoV陽(yáng)性。所有陽(yáng)性患兒的年齡均=6y，男14例，女3例。6月～1y患兒感染

23、率最高，為16.0％(8/50)。17例HBoV陽(yáng)性患兒均為肺炎和喘息性支氣管炎患者。14份(82.4％)合并其它呼吸道病毒感染。13株HBoV VP1/VP2基因擴(kuò)增成功，VP1/VP2基因序列種系發(fā)生分析表明，13株HBoV均與瑞典分離的代表株ST2株(1b簇)聚在一個(gè)分支上，均屬于Ib簇。
　　 (5)WUPyV238份下呼吸道感染的NPA標(biāo)本中，45份(18.9％)WUPyV VP2基因陽(yáng)性。陽(yáng)性患兒年齡中位數(shù)為9.0個(gè)

24、月(6d～6y)，=6個(gè)月檢出率最高(37.8％，17/45)，男28例，女17例。WUPyV陽(yáng)性標(biāo)本中，80％(36/45)與其他呼吸道病毒混合感染，其中RSV B占35.6％(16/45)。68份門診上呼吸道感染兒童的咽拭子標(biāo)本中，僅4.4％(3/68)為WUPyV VP2基因片段PCR擴(kuò)增陽(yáng)性，與上述下呼吸道感染的陽(yáng)性率18.9％相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=8.4，P=0.0037)。43例對(duì)照組兒童的咽拭子標(biāo)本經(jīng)WUPyV V

25、P2基因檢測(cè)均為陰性。
　　 結(jié)論：
　　 (1)流感病毒是冬春季重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的呼吸道病毒，2009年4月～2011年3月4個(gè)監(jiān)測(cè)季的優(yōu)勢(shì)流行亞型分別為季節(jié)性H3、新甲型H1N1、季節(jié)性H3和新甲型H1N1。季節(jié)性H3亞型流感病毒HA基因變異屬抗原漂移。
　　 (2)天津地區(qū)2009年6月出現(xiàn)新甲型H1N1流感病毒，2009年10月～2010年3月達(dá)流行高峰(76.8％)，2010年4月～2010年9月急劇下降(0.

26、6％)，2010年10月～2011年3月又成為優(yōu)勢(shì)流行亞型(51.5％)。新甲型H1N1流感病毒可引起肺炎等重癥呼吸道感染。新甲型H1N1流感病毒的HA、NA、M、NP和NS基因來(lái)源于豬流感病毒，PB2和PA基因來(lái)源于禽流感病毒，PB1基因來(lái)源于人流感病毒，其為三重重排病毒，與國(guó)外報(bào)道一致。目前的新甲型H1N1流感病毒基因與國(guó)外毒株相比，無(wú)顯著變異。NA氨基酸序列分析表明，天津地區(qū)無(wú)達(dá)菲耐藥株出現(xiàn)。
　　 (3)HMPV、HBo