Ski在細(xì)胞增殖、創(chuàng)傷愈合及瘢痕形成中作用與意義研究.pdf

1、細(xì)胞增殖是生命的基本特征，不但參與個(gè)體的發(fā)育、機(jī)體的修復(fù)等生理過(guò)程，而且參與難愈、瘢痕形成、腫瘤發(fā)生等病理過(guò)程。因此，合理調(diào)控細(xì)胞增殖，不僅有利于促進(jìn)組織修復(fù)，而且對(duì)提高修復(fù)質(zhì)量，抑制瘢痕乃至腫瘤形成具有重要意義。創(chuàng)傷愈合發(fā)生率極高，且緩慢的愈合過(guò)程和不良的愈合結(jié)果（例如增生性瘢痕和瘢痕疙瘩）是人類創(chuàng)傷愈合領(lǐng)域所面臨的兩大難題。盡管目前促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和抑制過(guò)度瘢痕形成的治療方法有很多，但是，在促愈和瘢痕治療之間還存在著一定的矛盾：如生長(zhǎng)因

2、子類促愈治療的同時(shí)具有加重瘢痕形成的風(fēng)險(xiǎn)；對(duì)于瘢痕的治療目前主要依賴經(jīng)驗(yàn)性治療，且治療效果不好，有的副作用大甚至影響愈合。另外，由于存在創(chuàng)傷后創(chuàng)面受體表達(dá)容易發(fā)生缺乏及變異、創(chuàng)面局部蛋白酶濃度升高、蛋白酶和其抑制因子比例失衡等因素，使受體類治療途徑難以達(dá)到理想促愈效果。因此，尋求新的非受體作用途徑的促增殖劑，對(duì)促進(jìn)創(chuàng)傷愈合尤其是放創(chuàng)復(fù)合傷、大面積創(chuàng)傷、燒傷等難愈傷口有著十分重要的意義。
　　 C-Ski作為一種鳥類癌基因v-sk

3、i的細(xì)胞內(nèi)同源物蛋白，在各種動(dòng)物中有較高的同源性，在人體中稱之為Ski。Ski在不同類型的組織和細(xì)胞中分布廣泛，不僅可以抑制Smad3/2 活性，還可調(diào)節(jié)多種核因子的轉(zhuǎn)錄活性，如促進(jìn)NFI（促核因子I）的轉(zhuǎn)錄、抑制癌基因Rb的轉(zhuǎn)錄等，從而參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、造血細(xì)胞的增殖和分化、腫瘤發(fā)生、組織再生等多種生理、病理過(guò)程。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Ski是一創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)基因，繼而，在大鼠切割傷模型上的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)Ski 具有在促愈的同時(shí)減輕瘢痕形成的

4、雙重作用，并在兔耳增生瘢痕模型上得到了驗(yàn)證。并且Ski表現(xiàn)出比現(xiàn)有促愈措施或抗瘢痕方法更好的效果，這不僅為同時(shí)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和抑制瘢痕形成這看似矛盾的效應(yīng)成為可能，而且提示Ski 可能是一個(gè)具有治療難愈性傷口和增生性瘢痕的臨床應(yīng)用前景的分子。
　　 已有文獻(xiàn)及前期研究表明Ski 可能是一個(gè)細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)因子，并具有促進(jìn)愈合和減輕瘢痕的雙重作用，但是，其在細(xì)胞增殖、創(chuàng)傷愈合及瘢痕形成中的作用機(jī)制還不清楚，尤其，作為原癌基因的Sk

5、i在多種人類惡性腫瘤中顯著表達(dá)，在這種細(xì)胞無(wú)限增殖病理過(guò)程中作用如何所知不多，不但影響其生物學(xué)效應(yīng)的闡明，也嚴(yán)重制約了其在創(chuàng)傷治療中的應(yīng)用前景。不過(guò)，已有研究表明Smad3 具有抑制細(xì)胞增殖的作用，表明抑制Smad3 可具有促進(jìn)增殖作用；同時(shí)，1999年美國(guó)NIH小組首次報(bào)道，Smad3基因敲除小鼠的傷口愈合速率增加了2倍，這一結(jié)果證實(shí)了抑制Smad3 具有促愈作用；
　　 另外，近些年研究表明TGF-beta信號(hào)系統(tǒng)尤其是Sm

6、ad3/2信號(hào)因子（他們轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)系統(tǒng)也稱為TGF-β1/Smad 依賴途徑）高活性是導(dǎo)致瘢痕形成的重要原因，因此，抑制Smad3/2 成為了減輕瘢痕形成的新途徑。而且，TGF-β1/Smad 依賴途徑抑制細(xì)胞增殖作用從而使TGF-β1具有抗腫瘤發(fā)生作用，此途徑的功能障礙被認(rèn)為是TGF-β1抗腫瘤作用喪失的原因。這些都提示Ski基因作為Smad3、Smad2的輔阻遏子，其可能通過(guò)調(diào)節(jié)Smad3/2 而在促進(jìn)增殖、傷口愈合、瘢痕形成甚至腫

7、瘤發(fā)生等方面發(fā)揮作用，是否如此需要進(jìn)一步的證實(shí)。
　　 為此，本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，分三個(gè)部分進(jìn)行如下研究：（1）Ski在細(xì)胞增殖及TGF-β1調(diào)節(jié)增殖中的作用研究：本部分研究采用原代成纖維細(xì)胞（Fibroblast，F(xiàn)B）和纖維肉瘤細(xì)胞（L929），通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，在明確TGF-β1對(duì)FB和L929 增殖調(diào)節(jié)作用不同的基礎(chǔ)上，利用RNAi 干擾c-Ski后結(jié)合TGF-β1刺激來(lái)驗(yàn)證Ski在其調(diào)節(jié)增殖中所發(fā)揮的作用，并探討其促

8、進(jìn)增殖的機(jī)理是否與其抑制Smad3/2 有關(guān)；進(jìn)一步，采用纖維肉瘤細(xì)胞移植瘤模型，對(duì)TGF-β1通過(guò)調(diào)節(jié)Ski 來(lái)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)行驗(yàn)證；
　　 （2）Ski在創(chuàng)傷愈合中的雙重作用和機(jī)理研究：首先，采用大鼠創(chuàng)傷及兔耳增生性瘢痕模型來(lái)觀察Ski 促愈和減輕瘢痕的雙重作用，并采用RNAi 干擾質(zhì)粒局部皮下注射來(lái)驗(yàn)證Ski 雙重作用的特異性；進(jìn)一步，利用Ski 裸質(zhì)粒治療大鼠創(chuàng)傷愈合模型，探討Ski 雙重作用的分子機(jī)制是否與調(diào)節(jié)TGF-

9、β1/Smad 依賴途徑有關(guān)；（3）Ski及TGF-β1/Smad 依賴途徑相關(guān)信號(hào)因子在人體增生性瘢痕中的表達(dá)觀察：利用收集的人體瘢痕標(biāo)本來(lái)檢測(cè)Ski及其相關(guān)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)規(guī)律，以此探討Ski在人體增生性瘢痕中的表達(dá)及與TGF-β1/Smad 依賴途徑的關(guān)系。
　　 主要結(jié)果與結(jié)論如下：
　　 1.在前期發(fā)現(xiàn)c-Ski 參與TGF-β1雙向調(diào)節(jié)FB細(xì)胞增殖變化作用的基礎(chǔ)上，本研究采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，c-Ski在L92

10、9細(xì)胞中持續(xù)高表達(dá)與TGF-β1對(duì)FB和L929的增殖調(diào)節(jié)存在著雙向到單向的轉(zhuǎn)變有關(guān)，并在動(dòng)物移植瘤實(shí)驗(yàn)中證實(shí)高表達(dá)的c-Ski促進(jìn)移植瘤持續(xù)生長(zhǎng)；此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與FB不同的是，L929細(xì)胞自分泌及移植瘤組織中的TGF-β1濃度持續(xù)增高。上述結(jié)果提示c-Ski是重要的細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)因子，且其持續(xù)、過(guò)高表達(dá)可能是L929 腫瘤細(xì)胞持續(xù)增殖的重要原因，而L929 腫瘤細(xì)胞分泌高濃度TGF-β1是其發(fā)揮持續(xù)增殖作用的基礎(chǔ)。Ski的這一重要作用可

11、能是創(chuàng)傷后細(xì)胞增殖在創(chuàng)傷修復(fù)完成后能自動(dòng)停止而腫瘤細(xì)胞不能停止的機(jī)制之一。
　　 2.前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)c-Ski的低表達(dá)增強(qiáng)Smad信號(hào)而c-Ski 高表達(dá)抑制Smad信號(hào)是高低濃度TGF-β1不同調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖作用不同的原因。本研究通過(guò)L929細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的Ski 雖然沒(méi)有改變Smad2/3的磷酸化水平，但可顯著抑制其下游信號(hào)因子P21的表達(dá)水平，提示高表達(dá)的c-Ski 可通過(guò)調(diào)節(jié)Smad 途徑參與TGF-β1的單向促進(jìn)

12、L929 增殖作用；不過(guò)，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)低濃度TGF-β1刺激24小時(shí)后，c-Ski表達(dá)水平增高但P21表達(dá)水平無(wú)明顯變化，而細(xì)胞增殖仍舊增高，提示高表達(dá)的c-Ski 促進(jìn)L929 增殖作用存在調(diào)節(jié)非Smad 途徑的可能。上述結(jié)果不僅表明c-Ski 調(diào)節(jié)增殖作用的分子機(jī)制與抑制Smad信號(hào)系統(tǒng)有關(guān)，而且為其能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖而參與調(diào)節(jié)愈合奠定基礎(chǔ)。
　　 3.細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)Ski不但具有促增殖作用還有調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化

13、和膠原分泌等作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)人體瘢痕標(biāo)本的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在病理性瘢痕中Ski表達(dá)相對(duì)較低而TGF-β1/Smad信號(hào)系統(tǒng)高表達(dá)，這不但為確定Ski在瘢痕形成中的作用提供了線索，也進(jìn)一步驗(yàn)證了TGF-β1/Smad信號(hào)系統(tǒng)在病理性瘢痕中的促進(jìn)作用。
　　 結(jié)合前期轉(zhuǎn)染Ski 實(shí)驗(yàn)可逆轉(zhuǎn)Smad3對(duì)成纖維細(xì)胞的促膠原分泌和抑制組織Smad信號(hào)及瘢痕形成的結(jié)果，表明低表達(dá)的Ski降低了對(duì)TGF-β1/Smad信號(hào)系統(tǒng)的抑制是病理性瘢痕形

14、成的原因之一，這為今后Ski在瘢痕形成中的作用及機(jī)制研究提供了有用的線索。
　　 4.前期通過(guò)轉(zhuǎn)ski基因?qū)嶒?yàn)在大鼠創(chuàng)傷模型中發(fā)現(xiàn)Ski 具有促愈和減輕瘢痕形成的雙重作用，且在兔耳增生性瘢痕模型上也取得同樣的結(jié)果。本研究采用RNAi 方法在大鼠創(chuàng)傷模型中發(fā)現(xiàn)干擾不僅顯著降低Ski表達(dá)水平，同時(shí)傷口愈合減慢和愈后瘢痕面積增大，這反向確認(rèn)了Ski 雙重作用來(lái)自于其本身。這不僅使同時(shí)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和抑制瘢痕形成這看似矛盾的效應(yīng)成為可

15、能，也為創(chuàng)傷愈合和瘢痕的早期干預(yù)性治療提供了新的思路。
　　 5.大鼠創(chuàng)傷模型愈合過(guò)程的病理學(xué)及免疫組化分析結(jié)果表明，新生上皮中c-Ski表達(dá)增高，且轉(zhuǎn)ski基因使其表達(dá)進(jìn)一步提高的同時(shí)使新生上皮明顯增多、爬行更遠(yuǎn)；
　　 轉(zhuǎn)ski基因側(cè)肉芽組織增多，Cyclin D和Col l表達(dá)增高且與Ski表達(dá)增高一致；另外，轉(zhuǎn)ski基因側(cè)創(chuàng)面內(nèi)CD11b(代表粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞標(biāo)志)陽(yáng)性細(xì)胞減少。上述結(jié)果提示轉(zhuǎn)ski基因

16、除調(diào)節(jié)增殖作用外，還可可通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)、加快上皮化、增加肉芽形成而達(dá)到促進(jìn)愈合作用。
　　 6.大鼠創(chuàng)傷模型愈后瘢痕的病理學(xué)及免疫組化分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)ski基因側(cè)膠原排布似網(wǎng)狀，瘢痕膠原成熟度高更接近正常皮下膠原，而且α－SMA 陽(yáng)性細(xì)胞減少、Col l表達(dá)降低，提示轉(zhuǎn)ski基因可通過(guò)減少膠原沉積和加快瘢痕組織重構(gòu)而達(dá)到抑制瘢痕形成作用。
　　 7.大鼠創(chuàng)傷模型的分子檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)ski基因抑制了Smad3/2的磷酸