輔阻遏子c-ski轉(zhuǎn)基因治療促進(jìn)傷口愈合和減輕瘢痕形成的作用研究.pdf

1、創(chuàng)傷是一個(gè)重要的疾病，在我國(guó)每年因創(chuàng)傷致傷數(shù)百萬(wàn)，更讓人擔(dān)憂的是，專家們預(yù)測(cè)，進(jìn)入21世紀(jì)以后，創(chuàng)傷人數(shù)可能成倍地增長(zhǎng)。為此，如何加快創(chuàng)傷后組織修復(fù)是臨床上的一個(gè)重要問題，也是提高損傷康復(fù)后生活質(zhì)量的需要。雖然，目前人們研究并發(fā)現(xiàn)了許多具有促增殖、抗凋亡的促修復(fù)因子，其中最有代表性的是生長(zhǎng)因子(bFGF、KGF等)，但是，由于這些因子中有的受到創(chuàng)面受體表達(dá)缺乏、變異、蛋白酶濃度升高及生長(zhǎng)因子比例失衡等因素的影響，難以達(dá)到理想的促愈效果，

2、有的甚至有增加瘢痕形成的副作用，使這些因子的應(yīng)用受到很大的限制。因此，探討正常創(chuàng)傷愈合的機(jī)制，尋求新的非受體作用途徑的促增殖劑，對(duì)促進(jìn)創(chuàng)傷愈合尤其是放創(chuàng)復(fù)合傷、大面積創(chuàng)傷、燒傷等難愈傷口有著十分重要的意義。 c-ski是鳥類病毒癌基因v-ski的細(xì)胞內(nèi)同源物，在不同類型的組織和細(xì)胞中分布廣泛。過量表達(dá)的ski可促進(jìn)雞胚成纖維細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其肌肉分化。c-ski可以抑制Smad3、Smad2活性，還可調(diào)節(jié)多種核因子的轉(zhuǎn)錄活性，如促

3、進(jìn)NFI(促核因子I)的轉(zhuǎn)錄而抑制癌基因Rb的轉(zhuǎn)錄，參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、造血細(xì)胞的增殖和分化、腫瘤發(fā)生、組織再生等多種生理病理過程。在創(chuàng)傷愈合方面c-ski有無作用呢？1999美國(guó)NIH小組首次報(bào)道，Smad3基因敲除小鼠的傷口愈合速率增加了2倍，這一結(jié)果證實(shí)了抑制Smad3具有促愈作用；同時(shí)，近些年研究表明TGF-beta信號(hào)系統(tǒng)是導(dǎo)致瘢痕形成的重要原因，而Smad3和Smad2做為TGF-beta途徑重要的信號(hào)因子，在瘢痕形成中具有重

4、要作用，因此，抑制Smad3和Smad2成為了減輕瘢痕形成的新途徑。這些都提示c-ski基因作為Smad3、Smad2的輔阻遏子，其可能在傷口愈合、瘢痕形成和放創(chuàng)復(fù)合傷愈合方面具有作用，但到目前為止尚未見有直接證據(jù)報(bào)道。 為此，本課題首先采用體外細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染技術(shù)來明確c-ski對(duì)成纖維細(xì)胞增殖及膠原分泌的作用，其次利用pcDNA3.0裸質(zhì)粒局部皮下注射來建立創(chuàng)傷愈合轉(zhuǎn)基因治療動(dòng)物模型并評(píng)價(jià)其應(yīng)用價(jià)值。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)c-sk

5、i在創(chuàng)傷愈合中的作用進(jìn)行以下兩個(gè)方面探討：(1)c-ski轉(zhuǎn)基因治療促進(jìn)大鼠皮膚傷口愈合的作用；(2)c-ski轉(zhuǎn)基因治療減輕大鼠愈后瘢痕和兔耳增生性瘢痕形成的效果，得到的主要結(jié)果與結(jié)論如下： 1.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)c-ski基因顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，且具有劑量依賴性；同時(shí)c-ski可降低Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)。提示c-ski作為一個(gè)促增殖因子在有促愈作用的同時(shí)，又因可降低膠原合成而具有潛在地抑制瘢痕形成的作用。 2.細(xì)胞實(shí)

6、驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：Smad3抑制增殖，而Smad2具有促增殖作用，c-ski可以逆轉(zhuǎn)Smad3對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用和Smad2對(duì)成纖維細(xì)胞的促增殖作用，明確了在成纖維細(xì)胞內(nèi)c-ski可以抑制Smad3和Smad2的作用，這不僅提示抑制Smad3的作用可能是c-ski促增殖的機(jī)理之一，而且說明抑制Smad2也可以降低細(xì)胞增殖作用，這也表明c-ski對(duì)成纖維細(xì)胞可能有雙重調(diào)節(jié)作用。 3.創(chuàng)傷愈合轉(zhuǎn)基因治療動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：pcDNA3.

7、0-lacZ質(zhì)粒可在大鼠傷口中表達(dá)，并且主要表達(dá)于皮下成纖維細(xì)胞，表達(dá)時(shí)間以一周內(nèi)為主，對(duì)照側(cè)無表達(dá)；同時(shí)利用檢測(cè)pcDNA3.0-f-c-ski質(zhì)粒的Flag標(biāo)簽蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)外源性c-ski可在大鼠傷口中表達(dá)，進(jìn)而WesternBlot檢測(cè)轉(zhuǎn)基因治療后c-ski表達(dá)量明顯高于對(duì)照并同時(shí)檢測(cè)到其中有flag抗體陽(yáng)性，表明pcDNA3.0-f-c-ski轉(zhuǎn)染可通過外源性c-ski表達(dá)而提高c-ski表達(dá)量，這為在體基因治療實(shí)驗(yàn)打下了堅(jiān)

8、實(shí)的基礎(chǔ)。 4.大鼠創(chuàng)傷模型c-ski裸質(zhì)粒局部皮下注射顯示：c-ski可以加快大鼠皮膚傷口愈合速度，愈合時(shí)間上比單純創(chuàng)傷對(duì)照縮短達(dá)25％左右，且具有顯著性差異；同時(shí)注射生理鹽水與單純創(chuàng)傷對(duì)照無差別，而注射空pcDNA3.0卻延長(zhǎng)傷口愈合時(shí)間，證明c-ski確實(shí)具有促進(jìn)傷口愈合作用。 5.c-ski促愈的量效及時(shí)效分析：在3-100ug/傷口的劑量范圍內(nèi)創(chuàng)面愈合縮短時(shí)間與劑量成正比，傷后即刻治療的愈合時(shí)間比傷后3天短；注

9、射頻率上，每周注射比單次注射治療的療效好；同時(shí)應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體與質(zhì)粒聯(lián)合轉(zhuǎn)染未發(fā)現(xiàn)有提高療效的作用。從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們得到了一個(gè)較佳的基因治療方案：傷后即刻開始，每周100ug/傷口劑量的裸質(zhì)粒局部皮下注射。 6.創(chuàng)傷后c-ski治療側(cè)在0-6天愈合速度快于對(duì)照側(cè)并有顯著性差別，在6-9天與對(duì)照差別不明顯，9天之后隨著剩余面積減小而創(chuàng)面愈合速度比對(duì)照減小，因此0-6天即創(chuàng)傷早期是c-ski促愈的關(guān)鍵時(shí)期，同時(shí)c-ski治療側(cè)表現(xiàn)

10、為炎性浸潤(rùn)下降、肉芽組織增多、上皮爬行快等，這些也可能是c-ski促愈的機(jī)制。 7.應(yīng)用貝復(fù)濟(jì)(rb-bFGF)做為療效的陽(yáng)性對(duì)照，我們發(fā)現(xiàn)c-ski轉(zhuǎn)基因治療側(cè)愈合時(shí)間為15.5天，而貝復(fù)濟(jì)治療側(cè)為17.1天，c-ski治療側(cè)比貝復(fù)濟(jì)治療側(cè)愈合時(shí)間縮短達(dá)10％左右，且愈后瘢痕面積c-ski治療側(cè)比對(duì)照側(cè)減小約50％，兩者相差具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 8.c-ski對(duì)大鼠傷口愈后的作用：在1.5月到2月之間瘢痕面積最大，c-sk

11、i基因治療可以抑制愈后瘢痕形成，在愈合后的各觀察時(shí)相點(diǎn)瘢痕面積均低于對(duì)照約50％；組織切片觀察膠原含量?jī)烧邿o明顯差別，但從分布上，c-ski治療側(cè)似網(wǎng)狀，瘢痕膠原成熟度高更接近正常皮下膠原，同時(shí)c-ski治療側(cè)無瘢痕向正常組織延伸現(xiàn)象，這可能是c-ski抑制瘢痕形成的因素之一。 9.c-ski對(duì)兔耳瘢痕模型的作用：c-ski可顯著促進(jìn)其創(chuàng)傷的愈合，并使瘢痕的外突高度及體積大為減少；組織切片觀察顯示c-ski治療側(cè)相對(duì)瘢痕厚度低，