mTOR信號通路與創(chuàng)傷愈合的相關(guān)性研究.pdf

1、背景和目的：
　　創(chuàng)傷修復(fù)是外科乃至整個醫(yī)學(xué)界所面臨的最重要、最基本的問題之一，也是目前臨床研究的熱點。隨著人類現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展和生物科學(xué)技術(shù)的進步，人們已經(jīng)認(rèn)識到可以在分子生物學(xué)、基因水平以及相關(guān)信號通路水平到對創(chuàng)面愈合進行有效主動的調(diào)控和探討。而且，到目前為止，大面積創(chuàng)傷，以及衰老體質(zhì)病人等創(chuàng)傷后出現(xiàn)的難愈性創(chuàng)面一直是臨床創(chuàng)傷修復(fù)治療的難題。因此，對創(chuàng)傷愈合發(fā)生機制的深入性研究具有非常重要的臨床意義。
　　創(chuàng)面愈合是由眾多

2、細(xì)胞因子(如PDGF(血小板來源的生長因子)、EGF(表皮生長因子)、bFGF(成纖維細(xì)胞生長因子)、IL-1(白細(xì)胞介素-1)等)介導(dǎo)和多種細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞)參與的一個復(fù)雜有序的生物學(xué)過程。在此過程中，受創(chuàng)組織需要加速合成大量與愈合相關(guān)的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)翻譯被激活是創(chuàng)面愈合進程中的必然事件。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路是調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯的主要信號通路，生長因子、氨基酸和胰島素等刺激因素通過此信號通路，

3、促進4E-BP1(蛋白翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白)的磷酸化，隨后eIF4E(蛋白翻譯起始因子4E)釋放并募集eIF4G(蛋白翻譯起始因子4G)和eIF4A(蛋白翻譯起始因子4A)形成三聚體的蛋白質(zhì)翻譯起始因子復(fù)合物eIF4F(蛋白翻譯起始因子4F)，進而上調(diào)帽依賴性mRNA翻譯蛋白質(zhì)。另一方面，mTOR也是維持細(xì)胞生長、新陳代謝以及血管發(fā)生的重要調(diào)控元件。而在創(chuàng)傷愈合過程分泌的多種生長因子，如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，

4、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)等都可能通過激活mTOR信號通路促進修復(fù)相關(guān)蛋白質(zhì)翻譯合成，進而促進細(xì)胞分裂增殖，促進創(chuàng)傷愈合。因此，探討這一信號通路在創(chuàng)傷愈合過程中的表達變化特點和調(diào)控機制，對于進一步闡明創(chuàng)傷愈合機制和豐富創(chuàng)傷愈合理論，以及尋找新的治療措施和新的藥物靶點具有重要的臨床意義。
　　為此，本實驗通過建立正常大鼠和治療組皮膚創(chuàng)傷模型，首先觀察正常大鼠和治療組大鼠創(chuàng)面

5、愈合水平差異，進而采用qRT-PCR、Western blot和ELISA等檢測方法，探討創(chuàng)面組織GM-CSF的表達變化特點和mTOR信號通路下游相關(guān)信號分子表達變化，最終為臨床治療新措施提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.建立正常組和GM-CSF治療組兩組創(chuàng)傷模型。
　　2.創(chuàng)傷后1d、3d、5d和7d，14d創(chuàng)面攝像觀察創(chuàng)面愈合率。然后在1d、3d，5d和7d取創(chuàng)面組織進行HE染色病理觀察，膠原染色，平滑肌肌動蛋白(α

6、-SMA)免疫組化，CD31分子蛋白Western Blotting檢測來觀察兩組模型創(chuàng)面愈合情況。
　　3.應(yīng)用qRT-PCR，ELISA檢測創(chuàng)面組織GM-CSF的表達。
　　4.Western Blotting檢測創(chuàng)面組織mTOR蛋白及其下游分子4E-BP1和P70S6k及其磷酸化蛋白的表達。
　　5.對所得數(shù)據(jù)進行t檢驗。
　　結(jié)果：
　　1.傷后1d，兩組大鼠創(chuàng)面愈合率接近；傷后3d-7d，治療組創(chuàng)

7、面愈合率明顯高于對照組(t值為2.704-4.030，P<0.05或P<0.01)。
　　2.HE染色可見，與對照組相比，治療組創(chuàng)面肉芽組織形成增多、細(xì)胞數(shù)量增加，傷后5d、7d微血管數(shù)量明顯增多，創(chuàng)緣角化上皮細(xì)胞增生明顯。
　　3.Massion染色顯示，在3d-7d時相點內(nèi)，治療組與對照組總膠原均出現(xiàn)表達上調(diào)，且治療組表達要高于對照組。
　　4.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在3d-7d時相點內(nèi)，治療組與對照組新生組織中α

8、-SMA表達出現(xiàn)表達上調(diào)的現(xiàn)象，且治療組表達要明顯高于對照組。
　　5.治療組傷后1d、3d、7d創(chuàng)面組織中CD31表達量均明顯高于對照組(t值為7.237-26.40，P值均小于0.01)。
　　6.ELISA法和qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，2組大鼠創(chuàng)面GM-CSF含量及相對表達量均在傷后3d達到峰值，對照組分別為(720.9±0.9)pg/mL、2.45±0.10，治療組分別為(910.5±1.3)pg/mL、2.80±

9、0.48。治療組各時相點GM-CSF含量均明顯高于對照組(t值為105.743-298.971，P值均為0.000)，治療組傷后1d、5d、7dGM-CSF相對表達量明顯高于對照組(t值為4.070-5.275，P值均小于0.01)。
　　7.治療組傷后各時相點創(chuàng)面組織中mTOR和p-mTOR表達量均明顯高于對照組(P<0.05或P<0.01)。治療組P70S6k表達量傷后3d、5d、7d明顯高于對照組(P<0.05或P<0.01