利用分子生物技術(shù)研究益生菌對斷奶仔豬生長及糞便菌群的影響.pdf

1、仔豬是現(xiàn)代化養(yǎng)豬生產(chǎn)的核心，其健康狀況對后期的生長發(fā)育產(chǎn)生極其重要的影響?，F(xiàn)代養(yǎng)殖中，為提高效益仔豬實行早期斷奶。斷奶后，食物由母乳變?yōu)轱暳?，再加上環(huán)境的改變，加劇斷奶應(yīng)激。導(dǎo)致仔豬免疫力下降，腹瀉率及死亡率升高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失。為減少這一風(fēng)險，在過去的50多年里，抗生素作為生長促進因子被大量用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，為養(yǎng)殖業(yè)做出了巨大貢獻。但是，抗生素的長期大量使用，破壞了機體的微生態(tài)平衡，導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生和細菌的變異，并容易造成動物內(nèi)

2、源性感染或二次感染，同時，肉制品中的藥物殘留時有發(fā)生，直接威脅人類的健康。因此，尋找無毒無害無殘留抗生素替代品迫在眉睫。在眾多潛在的替代品中，益生菌以其獨特的益生理念而備受推崇。
　　本文以斷奶仔豬為研究對象，研究了不同劑量的枯草芽孢桿菌，糞腸球菌，丁酸梭菌和凝結(jié)芽孢桿菌對仔豬生產(chǎn)性能、腹瀉率、血液生化指標(biāo)及糞便菌群的影響。隨后，以此為基礎(chǔ)，組成復(fù)合制劑，評價其對斷奶仔豬生長的影響。在技術(shù)手段上，采用分子生物學(xué)技術(shù)，變性梯度凝膠電

3、泳(DGGE)和實時熒光定量PCR(Real-timePCR)，結(jié)合微生物分子生態(tài)學(xué)方法研究益生菌對糞便菌群結(jié)構(gòu)組成的影響。
　　(1)Bacillus subtilis KN-42
　　360頭仔豬（斷奶日齡26±2d，平均體重7.14±0.63kg），按照體重和性別隨機分成20欄（18頭/欄;公∶母=1∶1），按照完全隨機設(shè)計，分成5個處理組:陰性對照組（簡稱NC;無抗生素?zé)o益生菌），陽性對照組（PC;每kg日糧中添加1

4、00mg的硫酸新霉素）;益生菌組（低、中、高3個劑量水平，簡稱L，M和H，每kg飼料中分別添加2×109，4×109和20×109CFU的B.subtilis K-42）。
　　根據(jù)基礎(chǔ)日糧的不同，實驗分成2個階段（Ⅰ:d1to14和Ⅱ:d15to28）。結(jié)果表明，整個實驗期，與組NC相比，組PC、M和H在日增重(ADG)和肉料比(G/F)上顯著提高（P＜0.05），組PC，組L，M和H的腹瀉率顯著降低(P＜0.05）;第28d采

5、集新鮮的糞便樣品，采用DGGE和Real-time進行分析。DGGE分析表明B.subtilisKN-42改變了的糞便的細菌群落結(jié)構(gòu)，組M的細菌多樣性指數(shù)和條帶數(shù)高于其它4個組;Real-time PCR分析表明，與組NC相比，組PC和H的Lactobacillus的相對數(shù)量顯著升高（P＜0.05），而E.coli的相對數(shù)量顯著減少(P＜0.05）。
　　(2)Enterococcus faecalis LAB31
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6、0頭仔豬(斷奶日齡26±2d，平均體重7.66±0.54kg)，按照隨機區(qū)組設(shè)計分成5個處理組:陰性對照組（簡稱NC），陽性對照組（PC;每kg日糧中添加100mg的硫酸新霉素）;益生菌組每kg飼料中分別添加0.5×109，1.0×109，2.5×109CFU的Enterococcus faecalis LAB31，簡稱L，M和H）。
　　整個實驗期，與NC相比，益生菌組L、M、H和組PC在ADG和G/F上顯著提高(P＜0.05）

7、;腹瀉率組NC顯著高于其它4組，組L顯著高于組H(P＜0.05)。第27d，每組采集5份血液樣品，分析表明白細胞，紅細胞和血紅蛋白濃度以及淋巴細胞的比例，各組之間均無顯著差異(P＞0.05）。第28d采集糞便樣品。DGGE及多樣性分析表明，組NC條帶及Shannon index H'最低，與組L和H相比，中劑量M更有利于細菌的多樣性。Real-time PCR分析表明，組PC和H在Lactobacillus相對含量上高于組NC和組L(P

8、＜0.05)。而類群DGGE分析表明，Lactobacillus組成穩(wěn)定。
　　(3)Clostridiumbutyricum B1
　　360頭仔豬(斷奶日齡26±2d，平均體重6.91±0.55kg)，按照完全隨機區(qū)組設(shè)計，分成5個處理組:陰性對照組（簡稱NC），陽性對照組（PC;每kg日糧中添加100mg的硫酸新霉素和75mg的喹烯酮）;益生菌組（每kg飼料中分別添加0.5×108，1×108和5×108CFU的C.b

9、utyricum B1，簡稱L，M和H）。
　　結(jié)果表明，整個實驗階段(d1to28)，抗生素組PC和益生菌組L在ADG和G/F上顯著高于陰性對照組，組PC和組L、M和H腹瀉率顯著低于NC，組M腹瀉率最低。第27d，白細胞，血紅蛋白，血小板，平均血紅蛋白濃度和淋巴細胞的濃度及比例，在各組之間均無顯著差異(P＞0.05）。然而，對于紅細胞的濃度，組H顯著高于組L。分別于第14d和28d采集糞便樣品，進行DGGE分析，點樣時，每組4個

10、重復(fù)，結(jié)果表明，總細菌及Lactobacillus群落個體間差異較大，梭菌占總細菌的比例最高，Lactobacillus以L.reuteri頻率最高。
　　(4)Bacilluscoagulans F5
　　實驗Ⅰ:120頭仔豬，斷奶日齡28±2d，平均體重8.01±0.64kg，按照完全隨機設(shè)計，分成4個處理:陽性對照組（PC;每kg日糧中添加80mg的金霉素）;益生菌組（每kg飼料中分別添加0.5×108，2.5×108

11、和12.5×108CFU的B.coagulans F5，分別簡稱L，M和H，）。飼喂14d后，分析表明高劑量組H在ADG和G/F上顯著高于低劑量組L(P＜0.05)，腹瀉率上各組之間無顯著差異（P＞0.05）。
　　實驗Ⅱ:360頭仔豬（斷奶日齡26±2d，平均體重7.69±0.46kg），按照完全隨機區(qū)組設(shè)計，5個處理組分別為陰性對照組（簡稱NC），陽性對照組（PC;每kg日糧中添加80mg的金霉素）;益生菌組（每kg飼料中分別

12、添加5×108，10×108和25×108CFU的B.coagulans F5，簡稱L，M和H），周期21d。結(jié)果表明，組M在ADG和G/F上顯著高于陰性對照NC(P＜0.05)，而組PC僅在G/F上高于組NC。在腹瀉指標(biāo)上，抗生素組PC，益生菌組M和H顯著低于陰性對照組NC(P＜0.05)?？偩鶧GGE及多樣性分析表明，各組Shannon'sindexH'無顯著差異(P＞0.05），但是，數(shù)值上組L和M遠高于組NC和PC。組之間無顯著

13、差異的原因是可能是個體差異較大。類群DGGE分析Lactobacillus表明，各組差異不大，出現(xiàn)在頻率最高及條帶相對密度最大是L.reuteri。Real-time PCR分析表明，PC組Lactobacillus的相對數(shù)量顯著高于NC組，NC組E.coli相對數(shù)量顯著高于抗生素組和益生菌組。
　　(5)復(fù)合益生菌制劑
　　160頭仔豬（斷奶日齡26±2d，平均體重7.08±0.82kg），按照完全隨機區(qū)組設(shè)計，分成4個處

14、理組:陰性對照組（簡稱NC），陽性對照組（PC;每kg日糧中添加80mg的金霉素）;益生菌組M1(B.subtilis，20×108，E.faecalis5×108，E.faecium5×108,C.butyricum0.3×108CFU/kg飼料)及M2(B.subtilis20×108,E.faecalis1.25×108，B.coagulans5×108,C.butyricum0.3×108CFU/kg飼料)。
　　實驗分成

15、2個階段(phaseⅠ:d1to14和phaseⅡ:d15to28)。在整個階段(d1to28)，益生菌組M1和M2在ADG和G/F上顯著高于組PC，組M2在G/F上顯著高于其它3組，組PC和M1顯著高于陰性對照組NC;而在腹瀉率上，組NC和PC顯著高于組M1和M2。糞便中乙酸，丙酸，丁酸及揮發(fā)性脂肪酸(VFA)在day14均無顯著差異(P＞0.05)，而在day28差異顯著(P＜0.05）。組NC的乙(酸)及內(nèi)酸濃度顯著高于其它各組(