Cbl-b-c-Cbl對(duì)CD8+DC發(fā)育的抑制作用及機(jī)制研究.pdf

1、Cbl蛋白家族是一類具有RING-finger結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶，在許多物種中保守存在。在哺乳動(dòng)物中家族有三個(gè)成員分別是c-Cbl、Cbl-b、Cbl-3，通過(guò)序列同源性比較，發(fā)現(xiàn) Cbl家族蛋白氨基末端具有一段高度保守的區(qū)域，由酪氨酸激酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域（tyrosine kinase binding domain，PTB）、環(huán)指結(jié)構(gòu)域（RING finger domain）和一段短的連接區(qū)域構(gòu)成。已有文獻(xiàn)報(bào)道 Cbl家族蛋白可以作為泛

2、素連接酶和多功能的接頭分子參與許多細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，包括調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞發(fā)育等，而且還在一些自身免疫疾病、炎癥和腫瘤等免疫病理學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。在免疫系統(tǒng)中Cbl家族主要起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，例如c-Cbl可以通過(guò)下調(diào)Zap-70、Syk來(lái)顯著抑制 T、B的功能，Cbl-b可以通過(guò)調(diào)控 T、B細(xì)胞信號(hào)的閾值來(lái)介導(dǎo)自身免疫性反應(yīng)的發(fā)生。而且有文獻(xiàn)報(bào)道Cbl家族在淋巴細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中起重要作用，例如在胸腺細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中c-Cbl通過(guò)下調(diào)Zap

3、70-Erk1/2活性來(lái)影響CD4+T細(xì)胞的發(fā)育，而且在胸腺細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中c-Cbl和Cbl-b可以增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)MHC分子的依賴，當(dāng)在小鼠中同時(shí)敲除 c-Cbl和Cbl-b，T細(xì)胞的發(fā)育可以不依賴于MHC分子。樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）是一類專職抗原遞呈骨髓來(lái)源的免疫細(xì)胞，主要可以分為cDC和pDC，根據(jù)其表面是否表達(dá) CD8和 CD11b，cDC又可以簡(jiǎn)單地分為 CD8+DC和 CD11b+DC。為了探索Cb

4、l家族是否在樹(shù)突狀細(xì)胞發(fā)育和行使功能過(guò)程中發(fā)揮一定的作用，我們構(gòu)建了在DC中特異性敲除c-Cbl和Cbl-b的雙敲除小鼠（CD11c Cre+ c-Cblf/f Cbl-b-/-，dKO)、c-Cbl單敲除小鼠（CD11c Cre+ c-Cblf/f）、Cbl-b單敲除小鼠（Cbl-b-/-）。
　　本文運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)雙敲除小鼠、單敲除小鼠和WT（野生型）小鼠骨髓和脾臟中的DC進(jìn)行免疫表型分析，我們發(fā)現(xiàn)在雙敲除小鼠骨髓中 CD8

5、+DC的比例和絕對(duì)數(shù)相對(duì)于單敲除小鼠和 WT小鼠明顯上升；在脾臟中，雙敲除小鼠的 CD8+DC和 CD103+DC的比例和絕對(duì)數(shù)相對(duì)于單敲除小鼠和 WT小鼠明顯上升，并且雙敲除小鼠 cDC的比例和絕對(duì)數(shù)相對(duì)于單敲除小鼠和 WT小鼠也是明顯上升的。然而當(dāng)敲除 c-Cbl和 Cbl-b后并不影響骨髓和脾臟中 pDC的比例和數(shù)量。為了研究在雙敲除小鼠脾臟中 CD8+DC和 CD103+DC是如何增多的，首先我們檢測(cè)了 CD8+DC和 CD10

6、3+DC的增殖和凋亡，流式結(jié)果顯示當(dāng)雙敲除 c-Cbl和 Cbl-b后并不影響 CD8+DC和 CD103+DC的增殖；當(dāng)雙敲除 c-Cbl和 Cbl-b后 CD8+DC和 CD103+DC的凋亡相比較于單敲除小鼠和 WT小鼠明顯降低。同時(shí)我們還檢測(cè)了 pre-DC在雙敲除小鼠、單敲除小鼠和 WT小鼠的情況，流式結(jié)果顯示不管是在雙敲除小鼠還是單敲除小鼠骨髓和脾臟中 pre-DC并沒(méi)有明顯變化。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)雙敲除 c-Cbl和 Cb

7、l-b后脾臟中CD8+DC的瞬時(shí)前體 CD24+DC的比例明顯升高、數(shù)量明顯增多，這說(shuō)明當(dāng)雙敲除 c-Cbl和 Cbl-b后影響了 pre-DC向 CD8+DC(CD24+DC)的發(fā)育。與此同時(shí)在體外用 Flt-3L培養(yǎng)雙敲除小鼠、單敲除小鼠和 WTWT小鼠的骨髓細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在雙敲除小鼠的培養(yǎng)體系中 CD24+DC和 CD103+DC的比例明顯升高，這也說(shuō)明了c-Cbl和 Cbl-b抑制了pre-DC向CD8+DC和CD103+DC的

8、發(fā)育。為了研究 c-Cbl和 Cbl-b抑制 pre-DC向 CD8+DC和 CD103+DC發(fā)育的分子機(jī)制，我們查閱文獻(xiàn)找出一些已知在 CD8+DC和CD103+DC發(fā)育過(guò)程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子如 ID2、Batf3、IRF8等，同時(shí)我們構(gòu)建了這些轉(zhuǎn)錄因子、c-Cbl和Cbl-b的表達(dá)質(zhì)粒。在體外我們將這些轉(zhuǎn)錄因子與 c-Cbl或/和 Cbl-b共表達(dá)于293T細(xì)胞中，western blot結(jié)果顯示當(dāng)與 c-Cbl共轉(zhuǎn)染時(shí)轉(zhuǎn)錄因子

9、 ID2、IRF4、IRF8、Batf3、PU.1、NICD的蛋白水平降低，與之對(duì)應(yīng)的泛素化水平升高；當(dāng)與 Cbl-b共轉(zhuǎn)染時(shí)轉(zhuǎn)錄因子 ID2、IRF4、IRF8、NICD的蛋白水平降低，與之對(duì)應(yīng)的泛素化水平升高；當(dāng)與 c-Cbl和 Cbl-b共轉(zhuǎn)染時(shí)只有轉(zhuǎn)錄因子 ID2、PU.1、Batf3的蛋白水平降低，與之對(duì)應(yīng)的泛素化水平升高。同時(shí)我們用流式分選出雙敲除小鼠、單敲除小鼠和 WT小鼠脾臟中的 CD8+DC和 CD103+DC以及骨髓

10、中的 pre-DC，western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子 ID2、IRF8、Batf3等的表達(dá)，結(jié)果顯示對(duì)于 CD8+DC，當(dāng)單敲除 c-Cbl或 Cbl-b或者是雙敲除 c-Cbl和 Cbl-b后轉(zhuǎn)錄因子ID2、Batf3、Notch1的蛋白水平相對(duì)于 WT CD8+DC明顯升高；對(duì)于CD103+DC，當(dāng)單敲除 c-Cbl或 Cbl-b或者是雙敲除 c-Cbl和 Cbl-b后轉(zhuǎn)錄因子ID2、Batf3、Notch1的蛋白水平相對(duì)于 W

11、T CD103+DC明顯升高，只是雙敲除 c-Cbl和 Cbl-b比單敲除 c-Cbl或 Cbl-b后IRF8的蛋白水平上升的更加明顯；對(duì)于pre-DC，轉(zhuǎn)錄因子IRF8、Batf3等在單敲除 c-Cbl或 Cbl-b或者是雙敲除 c-Cbl和 Cbl-b后都沒(méi)有變化?？偨Y(jié)我們現(xiàn)有的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn) c-Cbl和 Cbl-b抑制了 pre-DC向 CD8+DC/CD103+DC的發(fā)育，當(dāng)敲除 c-Cbl和 Cbl-b后，雙敲除小鼠脾臟中C