Cbl--b抑制CD4+T細(xì)胞活化分子機(jī)制研究.pdf

1、Cbl家族是一類具有RING-finger結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶，在許多物種中都保守存在。Cbl-b蛋白作為E3泛素連接酶和多功能的信號(hào)蛋白適配器，能對(duì)體內(nèi)外多種刺激產(chǎn)生應(yīng)答，廣泛參與并調(diào)節(jié)體內(nèi)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。早期有報(bào)導(dǎo)認(rèn)為在T細(xì)胞中，Cbl-b通過泛素化胞內(nèi)外受體、受體相關(guān)酪氨酸激酶以及下游信號(hào)分子從而抑制T細(xì)胞活化。因此，Cbl-b作為T細(xì)胞活化的限制點(diǎn)使其成為自體免疫疾病和腫瘤治療的分子靶點(diǎn)提供了可能。但Cbl-b抑制T細(xì)胞活化的具

2、體分子機(jī)制至今還不清楚。
　　miRNA是一組進(jìn)化保守的小分子RNA，無編碼蛋白質(zhì)的作用，它能通過干擾靶向信使RNA的穩(wěn)定或翻譯而調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生物學(xué)活動(dòng)。近年來，通過基因芯片和深度測(cè)序技術(shù)對(duì)T細(xì)胞發(fā)育和活化過程中不同階段miRNA的表達(dá)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn):miRNA在T細(xì)胞不同發(fā)育過程及活化前后出現(xiàn)顯著的變化，由此，猜想Cbl-b對(duì)CD4+T細(xì)胞活化的抑制作用是否通過影響某種特定的miRNA來實(shí)現(xiàn)。
　　通過CCK8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cb

3、l-b-/-小鼠的CD4+T細(xì)胞在抗CD3抗體的刺激下就可以被活化，而WT小鼠的CD4+T需要抗CD3和抗CD28的抗體同時(shí)存在才能被活化。腫瘤接種實(shí)驗(yàn)證明，胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc02和肺癌細(xì)胞株LLC細(xì)胞均不能在Cbl-b4-小鼠體內(nèi)有效生長(zhǎng)，這些結(jié)果和以往報(bào)道的研究結(jié)果相似，說明Cbl-b抑制了T細(xì)胞的活化，且Cbl-b的缺失會(huì)抑制腫瘤的生長(zhǎng)。為了探索Cbl-b抑制CD4+T細(xì)胞活化是否通過調(diào)控特定miRNA表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，我們首先通過M

4、icroarray技術(shù)檢測(cè)了WT和Cbl-b-/-小鼠CD4+T細(xì)胞以及用抗CD3抗體活化的WT和Cbl-b-/-小鼠CD4+T細(xì)胞miRNA譜，發(fā)現(xiàn)不管是非活化或活化狀態(tài)下，miR-99a和miR-125b在Cbl-b-/-小鼠的CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)均顯著高于在WT CD4+T。接下來，我們構(gòu)建了miR-99a和miR-125b過表達(dá)質(zhì)粒pMDH1-PGK-GFP-miR-99a和pMDH1-PGK-GFP-miR-125b，并通過

5、qPCR驗(yàn)證了pMDH1-PGK-GFP-miR-99a和pMDH1-PGK-GFP-miR-125b過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建成功，在此基礎(chǔ)上制備了miR-99a和miR-125b逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染小鼠T淋巴細(xì)胞系EL4制備穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。通過CCK8實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-99a或者miR-125b能使CD4+T細(xì)胞增殖升高。由此說明Cbl-b可能通過抑制miR-99a/miR-125b表達(dá)來抑制CD4+T細(xì)胞活化。那么Cbl-b又是如何調(diào)控m

6、iR-99a/miR-125b的表達(dá)?為了研究Cbl-b是如何調(diào)控miRNA進(jìn)而影響CD4+T細(xì)胞活化的分子機(jī)制，我們查閱文獻(xiàn)找出對(duì)miR-99a和miR-125b起重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子HOXA10。因此我們構(gòu)建熒光酶素報(bào)告質(zhì)粒，應(yīng)用熒光酶素報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證HOXA10與miR-99a和miR-125b的5'UTR結(jié)合情況，結(jié)果顯示當(dāng)過表達(dá)HOXA10促進(jìn)miR-99a和miR-125b表達(dá)。另外，我們通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)在WT小鼠中HO

7、XA10在CD3和CD28的雙信號(hào)刺激后才能轉(zhuǎn)位入核，而Cbl-b-/-小鼠則在只有CD3信號(hào)刺激時(shí)就能入核。這些結(jié)果提示Cbl-b缺失后，HOXA10在CD3信號(hào)刺激下就可以啟動(dòng)miR-99a和miR-125b的表達(dá)，從而使CD4+T細(xì)胞活化。這一結(jié)果使我們有理由推測(cè)，Cbl-b可能通過HOXA10-miR-99a和miR-125b調(diào)控T細(xì)胞活化。
　　為進(jìn)一步探討Cbl-b如何調(diào)控HOXA10入核，我們應(yīng)用STRING:fun

8、ctionalprotein association networks預(yù)測(cè)和Cbl-b、HOXA10相互作用的蛋白，進(jìn)一步交叉分析發(fā)現(xiàn)相關(guān)蛋白SHP-1和SHP-2可能和Cbl-b、HOXA10相互作用。因此我們從WT和Cbl-b-/-小鼠脾臟中用磁珠分選CD4+T細(xì)胞，體外活化刺激后提取蛋白，westernblot結(jié)果顯示，相對(duì)于WT小鼠，Cbl-b-/-小鼠中SHP-2的表達(dá)明顯升高，而SHP-1卻沒有明顯變化。同時(shí)我們構(gòu)建了SHP

9、-1，SHP-2的表達(dá)質(zhì)粒，在體外我們將SHP-1，SHP-2分別與Cbl-b共表達(dá)于293T細(xì)胞中，western blot結(jié)果顯示，當(dāng)與Cbl-b共轉(zhuǎn)染時(shí)，Cbl-b并未與SHP-2或者SHP-1結(jié)合。但我們用抗CD3抗體刺激WT和Cbl-b-/-小鼠中CD4+T細(xì)胞后，用Cbl-b抗體進(jìn)行免疫共沉淀，發(fā)現(xiàn)在TCR/CD3信號(hào)刺激下SHP-2和Cbl-b相互作用，可是同時(shí)接受CD3/CD28共刺激信號(hào)后，SHP-2和Cbl-b的結(jié)合

10、減弱。為證明SHP-2在活化后蛋白表達(dá)水平的降低是否是由于Cbl-b的E3泛素連接酶的作用，我們刺激活化WT和Cbl-b-/-小鼠中CD4+T細(xì)胞，裂解蛋白后對(duì)SHP-2進(jìn)行免疫共沉淀，檢測(cè)其泛素化水平，結(jié)果顯示在CD3信號(hào)刺激后泛素化明顯升高，而同時(shí)接受CD28共刺激信號(hào)后，泛素化水平又相對(duì)降低。同時(shí)我們也對(duì)SHP-2和HOXA10的相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)不管是否活化，SHP-2都與HOXA10結(jié)合。通過在體外將SHP-2和HOXA