大黃酚對(duì)黃瓜白粉病菌的抑制作用機(jī)制研究.pdf

1、黃瓜白粉病是由Saphaerotheca fuliginea Poll.引起的一種潛育期短、再侵染頻繁、流行性強(qiáng)的葉部病害。目前使用殺菌劑和抗病品種是防治白粉病的重要手段。但隨著藥劑的大量和長(zhǎng)時(shí)間使用,各地病原菌對(duì)一些藥劑產(chǎn)生了不同程度的抗性,防效大幅度降低。因此,開(kāi)發(fā)對(duì)瓜類(lèi)白粉病高效、低毒、低殘留的新型殺菌劑是當(dāng)前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
　　 本論文以游離蒽醌類(lèi)(Anthraquinone)化合物大黃酚(Chrysophanol)為

2、材料,采用室內(nèi)外生物測(cè)定相結(jié)合的方法,首先建立了黃瓜白粉病生物測(cè)定體系,并研究了大黃酚對(duì)黃瓜白粉病菌的保護(hù)和治療生物活性及作用方式；同時(shí)對(duì)大黃酚進(jìn)行了劑型加工和田間試驗(yàn)。隨后又從組織病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)方面研究了大黃酚對(duì)黃瓜白粉病菌的作用機(jī)制。此外,還研究了大黃酚對(duì)黃瓜白粉病菌孢子呼吸代謝的影響,以及寄主體內(nèi)與植物抗病相關(guān)酶基因變化規(guī)律。
　　 本研究取得了以下主要結(jié)果:
　　 1.建立了以下針對(duì)黃瓜白粉病菌的簡(jiǎn)便、快速的殺

3、菌劑生測(cè)體系:選用對(duì)白粉病菌高度感病黃瓜品種新長(zhǎng)春密刺,苗齡為5～10 d,菌齡10～15 d,接種濃度為30～40個(gè)孢子／視野(10×10倍顯微鏡)的懸浮液,采用子葉噴霧法或葉盤(pán)法進(jìn)行生物測(cè)定,曲利苯蘭染色后對(duì)白粉病菌的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段進(jìn)行組織學(xué)觀察。
　　 2.應(yīng)用子葉噴霧法測(cè)試了大黃酚及2種化學(xué)藥劑對(duì)黃瓜白粉病菌(S.fuliginea)的保護(hù)和治療生物活性。結(jié)果表明,大黃酚能有效降低黃瓜白粉病的病情指數(shù),其保護(hù)和治療作用

4、的EC50分別為33.36μg／mL和90.10μg／mL,對(duì)照藥劑硫磺懸浮劑保護(hù)作用的EC50為59.75μg／mL,苯醚甲環(huán)唑可濕性水分散粒劑治療作用的EC50為13.55μg／mL。
　　 3.采用噴霧法分別在黃瓜子葉期和真葉期研究了大黃酚對(duì)黃瓜白粉病菌的作用方式及其在寄主組織中的內(nèi)吸傳導(dǎo)性。大黃酚對(duì)黃瓜的保護(hù)作用具有較長(zhǎng)的持效期,在100μg／mL濃度下施藥20 d后接種白粉病菌,其防效仍達(dá)84.83％,與濃度為500μ

5、g／mL的硫磺懸浮劑防效相近。大黃酚在寄主組織中有一定的跨層傳導(dǎo)性,橫向傳導(dǎo)性較弱,幾乎沒(méi)有表現(xiàn)出向頂及向基的傳導(dǎo)性。
　　 4.將含有47％的大黃酚經(jīng)劑型加工得到了5％大黃酚懸浮劑,經(jīng)室內(nèi)和田間測(cè)定,其加工后的懸浮劑對(duì)黃瓜白粉病菌的防效優(yōu)異。在田間69 g(a.i)／hm2的使用劑量下防效達(dá)到88.9％。
　　 5.從組織病理學(xué)角度揭示了大黃酚對(duì)白粉病菌的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段進(jìn)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),2.4μg／mL大黃酚可有效

6、降低黃瓜白粉病菌分生孢子的萌發(fā)率和萌發(fā)芽管個(gè)數(shù),能抑制菌絲的生長(zhǎng)并減少新生分生孢子的個(gè)數(shù)。接種后24 h,清水對(duì)照萌發(fā)率為66.6％,而大黃酚處理后的孢子不萌發(fā)；接種后48 h,對(duì)照菌絲的平均長(zhǎng)度為414.7μm,大黃酚處理的菌絲平均長(zhǎng)度為40.1μm；接種后144 h,對(duì)照的新生分生孢子串最多為8個(gè)孢子,大部分為6～7個(gè),而大黃酚處理后新生分生孢子串最多為2個(gè)孢子,大部分為1個(gè)。接種7 d后對(duì)照的病情指數(shù)為72.2,大黃酚處理組的病情

7、指數(shù)僅為2.1,其保護(hù)作用防治效果達(dá)到97.1％,顯著高于50％硫磺懸浮劑65.4％的防效。
　　 6.電鏡觀察發(fā)現(xiàn)大黃酚作為保護(hù)劑使用時(shí),黃瓜白粉病菌的大部分孢子細(xì)胞壁破裂不能萌發(fā)侵入寄主,部分分生孢子的萌發(fā)受到明顯抑制,芽管或菌絲表現(xiàn)畸形,孢子表現(xiàn)皺縮、萌發(fā)侵入緩慢。侵染釘被致密乳突包圍,少數(shù)侵染釘能突破乳突產(chǎn)生畸形的吸器,吸器內(nèi)原生質(zhì)電子致密度加深,原生質(zhì)凝集,吸器中的細(xì)胞器逐漸解體成為泡囊,表明吸器即將解體。大黃酚作為治

8、療劑使用后,白粉病菌大部分萌發(fā)的芽管和附著胞畸形或破裂,菌絲頂端腫脹,部分菌絲塌陷、扭曲或斷裂、停止發(fā)育。大黃酚處理后寄主產(chǎn)生的乳突增多,且結(jié)構(gòu)致密,寄主細(xì)胞壁不規(guī)則加厚,染色加深,在寄主細(xì)胞壁與質(zhì)膜之間可以觀察到電子致密度加深的顆粒狀木栓化物質(zhì)沉積,產(chǎn)生的吸器被乳突包圍,敗育；即使有吸器生成,在形態(tài)上也發(fā)生了明顯的變化,吸器明顯畸形；吸器內(nèi)原生質(zhì)電子致密度加深,吸器外質(zhì)膜加厚,染色明顯加深,吸器產(chǎn)生空腔,液泡增大；一些吸器外基質(zhì)加寬,

9、吸器內(nèi)細(xì)胞器解體,有逐漸畸形壞死的趨勢(shì)。大黃酚作為鏟除劑使用時(shí),大黃酚處理后的黃瓜白粉病菌的分生孢子和菌絲扭曲、變形和塌陷。
　　 7.通過(guò)測(cè)定黃瓜白粉病菌分生孢子懸浮液加入大黃酚后其呼吸速率和抑制率的變化發(fā)現(xiàn),大黃酚對(duì)呼吸的磷酸戊糖途徑具有抑制作用,大黃酚與磷酸鈉的疊加率為10％
　　 8.通過(guò)對(duì)噴施大黃酚后黃瓜葉片內(nèi)的抗病相關(guān)酶活性的測(cè)定發(fā)現(xiàn),施藥后挑戰(zhàn)接種白粉病菌,PAL、葉綠素、木質(zhì)素和總酚含量增加,CAT、PP

10、O、POD活性和類(lèi)黃酮含量沒(méi)有明顯變化。PAL活性在接種后持續(xù)增加,并分別在接種后第2和7 d達(dá)到第一個(gè)和第二個(gè)峰值。在第7 d時(shí)酶活性約是丙酮接種對(duì)照組的4.9倍,而大黃酚處理后不接種的處理酶活性偏低。大黃酚處理后,無(wú)論是否接種,葉片葉綠素含量都上升,在接種后第3 d葉綠素含量是丙酮對(duì)照的1.8倍。施藥后無(wú)論是否接種白粉病菌,木質(zhì)素含量在接種后2 d達(dá)到第一個(gè)峰值,其中接種的處理木質(zhì)素含量是起初的4.9倍,不接種的處理木質(zhì)素含量是起初

11、的6.8倍,而丙酮溶液處理對(duì)照的木質(zhì)素含量表現(xiàn)的比較穩(wěn)定。大黃酚處理誘導(dǎo)提高了總酚的含量,施用大黃酚后接種黃瓜葉片苯總酚的含量分別于接種后1 d和5 d出現(xiàn)高峰,比丙酮接種對(duì)照組分別高出36％和23％。
　　 9.通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量,檢測(cè)到施用大黃酚后黃瓜植株的抗性相關(guān)酶的變化,PAL和chitinase基因能夠被誘導(dǎo)表達(dá)。在大黃酚處理接種后,PAL基因在接種后1 d表達(dá)量增高,接種后2 d PAL基因上調(diào)達(dá)到高峰,為起初的9.5