原子力顯微鏡對氧化應(yīng)激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞膜表面超微結(jié)構(gòu)的研究.pdf

1、目的：利用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)發(fā)生脂質(zhì)過氧化，建立氧化應(yīng)激模型。研究內(nèi)皮細(xì)胞從功能受損進(jìn)展到結(jié)構(gòu)改變的規(guī)律和特點(diǎn)，并試圖完成細(xì)胞間黏附分子-1(ICAlM-1)在內(nèi)皮細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)重現(xiàn)。 方法：以0.1％Ⅰ型膠原酶37℃消化15-20min人臍靜脈內(nèi)皮，分離獲得的原代HUVEC用低血清內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基重懸，37℃、5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)至融合后傳代：用Ⅷ因子相關(guān)抗原鑒定內(nèi)皮

2、細(xì)胞，將第2-3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞傳代，以一定的密度接種入培養(yǎng)板或塑料培養(yǎng)皿，使其于24小時(shí)內(nèi)貼壁生長，并達(dá)80％融合；以終濃度為100μg/ml的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)與HUVEC共同培養(yǎng)，按培養(yǎng)時(shí)間的不同分為0h、4h、8h、16h四實(shí)驗(yàn)組，各組內(nèi)設(shè)對照組，以等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)代替ox-LDL。MTT比色法比較四組細(xì)胞增殖活性；取細(xì)胞上清液比較四組細(xì)胞NO的含量以判斷HUVEC的功能狀態(tài)；應(yīng)用原子力顯微鏡(

3、AFM)觀察各組貼壁HUVEC表面超微結(jié)構(gòu)；選取0和16小時(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行ICAM-1免疫膠體金標(biāo)記，在AFM：下通過尋找金顆粒，對ICAM-1分子進(jìn)行定性，從而在內(nèi)皮細(xì)胞表面重現(xiàn)ICAM-1分子。 結(jié)果： 1.8h實(shí)驗(yàn)組活HUVEC數(shù)量低于0h實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，16h實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞數(shù)較0h、4h、8h實(shí)驗(yàn)組進(jìn)一步減少(P<0.05)。16h對照組活細(xì)胞數(shù)較0h、4h、8h對照組增加(P<0.05)。8小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組細(xì)

4、胞數(shù)低于同期對照組(P<0.05)。 2.8h實(shí)驗(yàn)組N0含量低于0h和4h實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)；16h實(shí)驗(yàn)組N0含量較8h實(shí)驗(yàn)組進(jìn)一步降低(P<0.05)。四對照組N0含量無顯著性差異(P>0.05)。8小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組N0含量低于同期對照組(P<0.05)。 3.4h實(shí)驗(yàn)組HUVEC表面顆粒開始聚集，分布出現(xiàn)紊亂，大的突起開始出現(xiàn)，且高于0h實(shí)驗(yàn)組；8h實(shí)驗(yàn)組與0h、4h實(shí)驗(yàn)組相比表面突起更加明顯，出現(xiàn)少量孔洞；16h實(shí)

5、驗(yàn)組與0h、4h、8h實(shí)驗(yàn)組相比，突起顯著增多，且出現(xiàn)較多空洞。0h、4h、8h及16h實(shí)驗(yàn)組粗糙度分別為13.666±2.196nm、15.904±2.203nm、17.688±2.076nm、21.609±1.867nm，兩兩相比均存在顯著性差異(P<0.05)；0h、4h、8h及16h對照。組粗糙度分別為13.627±2.218.nm、13.659±2.183nm、13.665±2.175nm、13.974±2.478nm，兩兩相

6、比無顯著性差異(P>0.05)；4小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組粗糙度高于同期對照組(P<0.05)。 4.金標(biāo)記二抗分子中的金顆粒在AFM Phase相圖片中表現(xiàn)為無拖尾的高亮斑，大小為21.548±1.692nm，對應(yīng)的Height相圖片中可見對應(yīng)的二抗分子，表現(xiàn)為類圓形顆粒，大小為50.944±4.404nm。 5.0h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)膠體金標(biāo)記后，AFM Phase相中僅見少量高亮斑，大小為53.826±5.367nm，與金標(biāo)記二抗涂

7、片的Phase相中高亮斑相比，存在顯著性差異(P<0.01)；對應(yīng)的Heigt相中無對應(yīng)的類圓形顆粒。16h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Phase相中可見較多高亮斑，大小為21.355±1.905nm，與金標(biāo)記二抗涂片的Phase相中高亮斑相比，無顯著性差異(P>0.05)，對應(yīng)Height相中對應(yīng)位置可見類圓形顆粒，大小為51.610±4.752nm，與金標(biāo)記二抗涂片的Height相中類圓形顆粒相比，無顯著性差異(P>0.05)。 6.對膠體金

8、標(biāo)記的16h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Height相進(jìn)行三維重建，可見半球形的金標(biāo)二抗，與之比鄰處為形態(tài)不規(guī)則的突起，似山峰狀，平均大小為170nm×220nm，Z軸上平均高度為22±2.326nm。 結(jié)論 1.ox-LDL可抑制HUVEC的增殖活性，減少活細(xì)胞數(shù)目，致HUVEC的功能減退，呈時(shí)間依賴性。 2.在AS形成過程中，HUVEC表面超微結(jié)構(gòu)在較早期就發(fā)生了改變，并隨時(shí)間推移呈現(xiàn)動態(tài)變化。 3.HUVEC表面增多