芍藥苷對(duì)晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的干預(yù)作用.pdf

1、研究背景與目的：
　　氧化應(yīng)激(oxidative stress)是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，組織或細(xì)胞內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡被打破，各類自由基，如活性氧自由基(reactiveoxygen species，ROS)以及活性氮自由基(Reativenitrogen species，RNS)無(wú)法及時(shí)被清除，而在機(jī)體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)蓄積引起一系列病理生理反應(yīng)，從而導(dǎo)致組織損傷的過程。
　　芍藥苷(paeoniflorin)是中

2、藥赤芍的主要有效成分之一，是一種單萜類糖苷化合物。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)芍藥苷展開了較為深入的研究，發(fā)現(xiàn)其具有多種生物學(xué)效應(yīng)，并且毒副作用較小。已有報(bào)道，芍藥苷能夠抗自由基損傷，抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載活性。而在細(xì)胞學(xué)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，芍藥苷能夠通過提高谷胱甘肽(GSH)水平抑制6-OH多巴胺誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其原因可能主要源于其抗氧化能力;此外，芍藥苷在不影響Akt，JNK，p38和ERK1/2磷酸化的情況下，可以顯著減

3、弱6-OH多巴胺誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞核因子κB(NF-κB)易位。
　　然而，芍藥苷是否能夠消除AOPPs對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體的破壞作用，抑制ROS的生成，以降低其氧化損傷？是否通過干預(yù)AOPPs刺激下RAGE-NADPH(Nox2/Nox4)—ROS—NF-κB—HIF-1α/VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以實(shí)現(xiàn)其針對(duì)AS病程的干預(yù)？這些假設(shè)需要我們進(jìn)一步試驗(yàn)證明。
　　研究方法：
　　2.1 無(wú)內(nèi)毒素AOPPs

4、的制備與鑒定
　　按照David R改良的Witko-sarsat法制備晚期過氧化物修飾蛋白儲(chǔ)存液。按照Witko-Sarsat等的紫外分光光度法測(cè)定AOPPs對(duì)氯胺-T的相對(duì)濃度(μM);BCA法測(cè)定AOPPs和未修飾的BSA樣品中總蛋白的含量(mg/ml);凝膠鱟試劑定性檢測(cè)AOPPs和未修飾BSA中內(nèi)毒素的含量。
　　2.2 MTT法檢測(cè)AOPPs和芍藥苷對(duì)HUVECs活性的影響
　　采用MTT還原法先測(cè)定不同濃

5、度的AOPPs和200μg/ml BSA以及不同濃度芍藥苷對(duì)細(xì)胞活性的影響。然后測(cè)定不同濃度芍藥苷預(yù)處理對(duì)AOPPs刺激的HUVECs活性的影響。
　　2.3 DCFH-DA熒光探針檢測(cè)AOPPs對(duì)HUVECs內(nèi)ROS水平的影響以及芍藥苷的干預(yù)作用
　　DCFH-DA熒光探針先檢測(cè)不同濃度的AOPPs孵育90 min以及200μg/mlAOPPs孵育不同時(shí)間對(duì)HUVECs內(nèi)ROS的生成量的影響。然后測(cè)定不同濃度的芍藥苷以及不

6、同阻斷劑:RAGE受體阻斷劑FPS-ZM1(230 nM)，NADPH氧化酶抑制劑Apocynin(100μM)，氧自由基清除劑NAC(5 mM)對(duì)AOPPs誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生ROS的阻斷作用。
　　2.4 Fluo-3 AM熒光染料檢測(cè)AOPPs對(duì)HUVECs內(nèi)Ca2+水平的影響以及芍藥苷的干預(yù)作用
　　Fluo-3 AM熒光染料檢測(cè)不同濃度的AOPPs與BSA刺激HUVECs內(nèi)Ca2+的波動(dòng)情況。同時(shí)檢測(cè)芍藥苷(200

7、μM)以及不同阻斷劑:FPS-ZM1、Apocynin、和NAC對(duì)AOPPs刺激HUVECs內(nèi)Ca2+超載的抑制情況。
　　2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)AOPPs對(duì)HUVECs線粒體膜電位水平的影響以及芍藥苷的干預(yù)作用
　　我們通過MitoTracker(R)Deep Red and MitoTracker(R) Green雙染標(biāo)記HUVECs，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度的AOPPs和BSA對(duì)HUVECs線粒體膜電位的影響。同時(shí)檢

8、測(cè)芍藥苷(200μM)以及不同阻斷劑:Apocynin、FPS-ZM1、NAC對(duì)AOPPs造成的細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位功能障礙的恢復(fù)情況。
　　此外我們還使用激光共聚焦成像系統(tǒng)觀察記錄AOPPs和BSA與HUVECs孵育不同時(shí)間線粒體膜電位的變化情況。
　　2.6 ATP試劑盒檢測(cè)AOPPs對(duì)HUVECs內(nèi)ATP水平的影響以及芍藥苷的干預(yù)作用
　　根據(jù)ATP檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)不同濃度的AOPPs和BSA對(duì)HUVECs內(nèi)A

9、TP水平的影響情況，同時(shí)檢測(cè)芍藥苷(200μM)以及不同阻斷劑:Apocynin，F(xiàn)PS-ZM1和NAC對(duì)AOPPs耗竭HUVECs內(nèi)ATP的恢復(fù)情況。
　　結(jié)果：
　　3.1 AOPPs的鑒定
　　結(jié)果顯示AOPPs含量為142.4±9.8μmol/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未修飾的BSA的0.2±0.02μmol/g。且所有AOPPs制備品經(jīng)凝膠法鱟試劑測(cè)定內(nèi)毒素含量均低于0.25EU/ml。
　　3.2 AOPPs以及芍

10、藥苷對(duì)HUVECs活性的影響
　　檢測(cè)結(jié)果顯示，≥200μg/ml AOPPs與NC組相比較，對(duì)細(xì)胞活性有顯著影響(p＜0.01);50-400μM芍藥苷與NC組相比較，對(duì)細(xì)胞活性無(wú)顯著影響。芍藥苷預(yù)處理1h，然后加入AOPPs孵育24 h，結(jié)果顯示50-400μM芍藥苷與AOPPs組相比較，均能夠提高細(xì)胞存活率(p＞0.05)。
　　3.3 AOPPs對(duì)HUVECs內(nèi)ROS的影響以及芍藥苷的抑制作用
　　未經(jīng)修飾的B

11、SA不能誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生ROS，而AOPPs能夠刺激HUVECs產(chǎn)生大量的ROS，與NC組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);于200μg/ml濃度在90min時(shí)達(dá)到峰值。而芍藥苷以及不同阻斷劑:Apoeynin、FPS-ZM1、NAC預(yù)處理HUVECs均能部分抑制ROS的產(chǎn)生，與AOPPs組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　3.4 AOPPs對(duì)HUVECs內(nèi)Ca2+的影響以及芍藥苷的抑制作用
　　未經(jīng)修飾的BS

12、A對(duì)HUVECs內(nèi)Ca2+波動(dòng)無(wú)影響，而AOPPs呈濃度依賴性的方式升高HUVECs內(nèi)的Ca2+濃度，與NC組相比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。芍藥苷以及不同阻斷劑:Apocynin、FPS-ZM1、NAC預(yù)處理細(xì)胞均能部分抑制AOPPs導(dǎo)致的Ca2+超載，且與AOPPs組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　3.5 AOPPs對(duì)HUVECs線粒體膜電位的影響以及芍藥苷的保護(hù)作用
　　結(jié)果顯示，AOPPs呈濃度依賴性

13、的方式降低HUVECs線粒體膜電位，與NC組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);此外芍藥苷與不同阻斷劑:Apocynin、FPS-ZM1、NAC預(yù)處理HUVECs均可以部分阻斷AOPPs對(duì)HUVECs造成的線粒體功能障礙，與AOPPs組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。
　　3.6 AOPPs對(duì)HUVECs內(nèi)ATP的影響以及芍藥苷的抑制作用
　　HUVECs內(nèi)ATP的濃度隨AOPPs濃度的升高而降低，與NC組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)

14、意義(p＜0.05)，而未被修飾的BSA對(duì)HUVECs內(nèi)的ATP水平無(wú)影響。芍藥苷以及不同阻斷劑:Apocynin、FPS-ZM1、NAC預(yù)處理HUVECs1 h，均能部分恢復(fù)AOPPs降低HUVECs內(nèi)的ATP水平，與AOPPs組相比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　芍藥苷能夠有效地保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞因AOPPs誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。其保護(hù)的機(jī)制可能是阻斷AOPPs與RAGE受體的結(jié)合從而抑制Nox2/Nox