原子力顯微鏡用于細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的研究以及單堿基錯(cuò)配的檢測(cè).pdf

1、生物大分子所構(gòu)筑的細(xì)胞表面(細(xì)胞壁、細(xì)胞膜)是細(xì)胞與外界環(huán)境間進(jìn)行物質(zhì)和能量交換的屏障，也是一些物理、化學(xué)因素作用于細(xì)胞的靶點(diǎn)之所在。在納米水平上研究細(xì)胞表面的基本結(jié)構(gòu)及其受外界環(huán)境作用前后的變化，對(duì)于認(rèn)識(shí)細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，全面評(píng)價(jià)藥效并對(duì)藥物合成路線提供參考都具有重要意義。另一方面，單堿基錯(cuò)配的檢測(cè)對(duì)于從分子水平上闡明多種疾病形成的原因，實(shí)現(xiàn)基因水平的治療都是至關(guān)重要的前提條件。發(fā)展具有高靈敏度、高選擇性的單堿基錯(cuò)配檢測(cè)方

2、法勢(shì)在必行。上述兩個(gè)研究領(lǐng)域都已經(jīng)成為生物分析化學(xué)研究的前沿和熱點(diǎn)。 本論文以上述科學(xué)問(wèn)題為研究目標(biāo)，充分利用原子力顯微鏡(AFM)能夠在大氣及液下高分辨成像和對(duì)微弱相互作用力敏感的優(yōu)勢(shì)，表征了不同藥物以及脈沖電場(chǎng)(PEF)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁表面形態(tài)和構(gòu)成的影響，考察了細(xì)胞在大氣氛和液下成像的條件，發(fā)展了基于力測(cè)定并結(jié)合發(fā)夾型探針的高靈敏、高選擇性的單堿基錯(cuò)配檢測(cè)方法。主要內(nèi)容歸納如下： 1、基于AFM大氣氛中成像，研究天然與

3、半合成內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)大腸桿菌形態(tài)的影響。選擇具有微小分子結(jié)構(gòu)差別的天然(青霉素)和半合成(阿莫西林)抗生素，分別對(duì)大腸桿菌進(jìn)行作用。利用AFM大氣氛中制樣簡(jiǎn)便、輕敲模式成像分辨率高、樣品損傷性小的優(yōu)勢(shì)，對(duì)藥物的作用效果進(jìn)行了表征。觀察到這兩種藥物在細(xì)菌表面造成的納米水平上小孔狀損傷的密度和發(fā)生位點(diǎn)均存在區(qū)別，從形態(tài)學(xué)角度解釋了阿莫西林比青霉素藥效強(qiáng)的原因。作為對(duì)照的氧氟沙星未使細(xì)菌表面出現(xiàn)顯著的損傷。該結(jié)果在納米水平上證明了不同抗生素

4、的藥效，同時(shí)也表明AFM能夠?yàn)檠芯克幬锓肿咏Y(jié)構(gòu)與作用效果的關(guān)系提供新的表征手段。 2、結(jié)合AFM液下成像和力測(cè)定兩種技術(shù)，研究了PEF對(duì)細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)與構(gòu)成的影響。對(duì)通過(guò)靜電吸附固定于基底上的細(xì)菌樣品，原位施加不同劑量的PEF，表征了菌體形態(tài)及其與AFM探針的相互作用力的變化。結(jié)果表明隨著PEF劑量的增加，細(xì)菌表面損傷的程度逐漸增大，具體表現(xiàn)為細(xì)菌數(shù)目的減少、相互作用力的增大以及力曲線上出現(xiàn)多粘附相互作用特征區(qū)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明相互作

5、用力的變化是由于細(xì)胞壁外層的肽聚糖分子網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)被破壞，從而使內(nèi)膜中的蛋白組分暴露所致。該結(jié)果在分子水平上證明了PEF對(duì)細(xì)菌表面的影響，同時(shí)也表明AFM是研究細(xì)胞表面組分變化與外界物化刺激之間相互關(guān)系的強(qiáng)有力的工具。 3、氣氛中及生理環(huán)境下AFM細(xì)胞成像的實(shí)現(xiàn)及條件優(yōu)化。首先，比較了三種常用的固定劑對(duì)三種細(xì)胞在大氣氛中成像效果的影響。其中，0.5％的戊二醛具有對(duì)細(xì)胞細(xì)微結(jié)構(gòu)的最佳保留能力。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了掃描速度和不同培

6、養(yǎng)基環(huán)境對(duì)細(xì)胞液下成像的影響并進(jìn)行了條件優(yōu)化。貼壁生長(zhǎng)的腎系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞均可在培養(yǎng)基中直接進(jìn)行成像，細(xì)胞骨架清晰。該結(jié)果為將AFM成像和力測(cè)定及其聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用到細(xì)胞水平搭建了一座橋梁。 4、AFM力譜分析用于增強(qiáng)發(fā)夾型探針的單堿基錯(cuò)配檢測(cè)能力。將探針與完全互補(bǔ)和一系列含有不同類型單堿基錯(cuò)配的互補(bǔ)序列分別修飾到針尖與基底上，通過(guò)測(cè)量探針與完全互補(bǔ)以及錯(cuò)配序列之間的相互作用力，對(duì)單堿基錯(cuò)配進(jìn)行檢測(cè)。不同于熒光檢測(cè)時(shí)