骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植途徑對(duì)大鼠急性心肌梗死修復(fù)的影響.pdf

1、目的:比較經(jīng)不同途徑移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）治療大鼠急性心肌梗死（AMI）的修復(fù)作用，探求更為適合的移植途徑。
　　方法:1、運(yùn)用全骨髓貼壁法培養(yǎng)細(xì)胞和純化細(xì)胞，取P3代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD34、CD44。2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)、鑒定和標(biāo)記：5-氮胞苷作為誘導(dǎo)劑將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞方向誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后免疫細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行細(xì)胞鑒定，心肌細(xì)胞表面標(biāo)志物cTnT。移

2、植前1 h應(yīng)用4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）標(biāo)記細(xì)胞核。3、SD大鼠AMI模型的建立及鑒定：采取結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈前降支的方式，建立AMI的大鼠模型。心電圖可見肢體導(dǎo)聯(lián)ST段呈弓背向上抬高繼而出現(xiàn)異常Q波，結(jié)扎血管所供應(yīng)的心肌組織變蒼白，梗死心肌的形態(tài)觀察，可鑒定為造模成功。4經(jīng)不同途徑移植心肌樣細(xì)胞：將造模成功的大鼠分為4組，每組10只：1）對(duì)照組AMI后不予處理；2）靜脈移植組為AMI后經(jīng)尾靜脈移植心肌樣細(xì)胞懸液200l(心

3、肌樣細(xì)胞5×106)；3）心外膜移植組為AMI后于梗死周邊區(qū)均勻分4個(gè)部位移植心肌樣細(xì)胞懸液共200 ul,每個(gè)部位50 ul；4）聯(lián)合移植組為AMI后分別經(jīng)尾靜脈和心外膜移植心肌樣細(xì)胞懸液各200 ul。4周后稱取大鼠體重和左心室重量，蘇木精-伊紅染色方法觀察SD大鼠心肌組織形態(tài)，熒光顯微鏡下觀察移植細(xì)胞的分布情況，免疫印跡法分析心肌組織蛋白ACE2的表達(dá)情況。所得數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS17.0版本的軟件對(duì)數(shù)據(jù)資料統(tǒng)計(jì)分析。

4、多個(gè)均數(shù)間比較采用單因素方差分析。進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)24h后，顯微鏡下見大量懸浮細(xì)胞，折光性強(qiáng)，培養(yǎng)液渾濁，少量細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)多樣；隨著培養(yǎng)基不斷更換，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生不斷變化，最終呈漩渦狀生長(zhǎng)，形態(tài)較均一，呈梭形。傳代48h后，由于胰酶作用，部分細(xì)胞皺縮、脫壁，導(dǎo)致懸浮細(xì)胞較多，貼壁細(xì)胞減少；之后，細(xì)胞恢復(fù)形態(tài)，數(shù)量逐漸升高，第7d時(shí)，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到

5、最多。細(xì)胞形態(tài)更加均一，呈短梭形。取P3代細(xì)胞，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44表達(dá)陽(yáng)性，CD34表達(dá)陰性。2、誘導(dǎo)P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，采用5-氮胞苷向心肌樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)，但生長(zhǎng)速度較誘導(dǎo)前慢，開始出現(xiàn)細(xì)胞集落融合；4w后，細(xì)胞體積變大，呈長(zhǎng)梭形，排列方向趨于一致。誘導(dǎo)后的細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色顯示，cTnT表達(dá)陽(yáng)性。3、結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈前降支，可見結(jié)扎部位以下心肌變蒼白，心電圖提示ST段抬高，組織切片顯示心肌

6、纖維排列紊亂，甚至斷裂，細(xì)胞核破裂，纖維組織增生。4、各移植組的左心室重量指數(shù)較對(duì)照組均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），聯(lián)合移植組的左心室重量指數(shù)較靜脈移植組、心外膜移植組的下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。5、被DAPI標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植入大鼠體內(nèi)，在熒光顯微鏡下觀察，心肌樣細(xì)胞核呈藍(lán)色圓形或橢圓形熒光，靜脈移植組大鼠心肌內(nèi)可見少量散在分布的陽(yáng)性細(xì)胞，心外膜移植組可見梗死心肌周邊陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較多，聯(lián)合移植組陽(yáng)性細(xì)

7、胞數(shù)量最多。6、蘇木精-伊紅染色顯示對(duì)照組（即單純心肌梗死組）大鼠的心肌纖維排列紊亂甚至斷裂、消失，細(xì)胞核破裂，纖維組織增生多；靜脈移植組、心外膜移植組心肌纖維排列較亂，細(xì)胞核破裂數(shù)目較少，少量纖維組織增生；聯(lián)合移植組心肌纖維排列尚整齊，少量細(xì)胞核肥大，纖維組織增生較多，與正常組織界限清晰。正常心肌組織切片顯示心肌纖維排列有序，細(xì)胞核完整，無(wú)纖維組織增生。7免疫印跡分析結(jié)果顯示，靜脈移植組、心外膜移植組、聯(lián)合移植組大鼠心肌組織ACE2表