小鼠腦發(fā)育相關(guān)lncRNAs的高通量篩選及注釋平臺構(gòu)建.pdf

1、長非編碼RNAs（lncRNAs）是長度在200 nt以上的非編碼RNAs，在胚胎發(fā)育、癌癥、病痛和炎癥等過程中發(fā)揮重要的作用。然而，目前公共數(shù)據(jù)庫中小鼠lncRNAs數(shù)據(jù)較少，而其中被功能注釋的則更少。腦組織是lncRNAs表達(dá)的主要器官，預(yù)測腦表達(dá)lncRNAs對于全面識別小鼠腦發(fā)育相關(guān)的lncRNAs及認(rèn)識其在腦發(fā)育中的作用具有重要意義。此外，將預(yù)測的lncRNAs與已知lncRNAs進(jìn)行整合、注釋并存儲進(jìn)專門的數(shù)據(jù)庫中對于lnc

2、RNAs的規(guī)范化和再利用具有重要意義。小鼠 DNA元件百科全書計劃測定了大量組織和細(xì)胞系的RNA測序（RNA-Seq）和染色質(zhì)免疫共沉淀測序等高通量數(shù)據(jù)，對于預(yù)測新的lncRNAs提供了一個新的思路。因此，本研究收集大量組織和細(xì)胞系的RNA-Seq數(shù)據(jù)，基于RNA-Seq篩選鑒別新lncRNAs，通過基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組和功能基因組學(xué)表征證明其有效性，利用模型進(jìn)行特征選擇從而篩選腦發(fā)育相關(guān)的lncRNAs。整合已知和基于大規(guī)模 R

3、NA-Seq數(shù)據(jù)預(yù)測的lncRNAs，構(gòu)建lncRNAs注釋平臺和開發(fā)分析工具，便利研究人員的使用。
　　本論文首先對已有的RNA-Seq流程進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而篩選胚胎腦發(fā)育相關(guān)的基因間、內(nèi)含子和順式反義3種類型 lncRNAs。分別從基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組和功能基因組學(xué)方法表征胚胎腦發(fā)育相關(guān)的新 lncRNAs，并與已知lncRNAs和編碼轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比較。結(jié)果表明新lncRNAs具有相對完整的基因結(jié)構(gòu)及較低的編碼潛能，具有與已知

4、lncRNAs相似的組織特異性，并與典型的染色質(zhì)修飾相關(guān)。功能富集分析和基于RNA干擾的分析結(jié)果表明胚胎腦發(fā)育相關(guān)的lncRNAs具有潛在的腦發(fā)育調(diào)控功能和結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能的傾向。隨機(jī)挑選的lncRNAs的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)一步表明lncRNAs具有較強(qiáng)的發(fā)育階段特異性并且可能受到印記機(jī)制調(diào)控。
　　其次，LASSO調(diào)整的羅杰斯特回歸模型在本論文中被用于篩選 lncRNAs與編碼轉(zhuǎn)錄本之間的基因組和表觀基因組學(xué)差異。由于使用了3個

5、發(fā)育階段的染色質(zhì)修飾數(shù)據(jù)，因此差異的特征可并用于篩選腦發(fā)育過程相關(guān)的lncRNAs。對模型進(jìn)行十倍交叉證實(shí)和獨(dú)立檢驗(yàn)集測試后發(fā)現(xiàn)特征選擇模型的性能和只使用基因組特征和染色質(zhì)修飾特征相近，表明少數(shù)特征對lncRNAs的預(yù)測發(fā)揮了主要作用?；谔卣鬟x擇模型對3個發(fā)育階段的RNA-Seq數(shù)據(jù)預(yù)測的候選lncRNAs進(jìn)行進(jìn)一步篩選。通過對新lncRNAs進(jìn)行的基因組、轉(zhuǎn)錄組和功能基因組學(xué)方法表征表明模型篩選腦發(fā)育相關(guān)lncRNAs的有效性。研究

6、lncRNAs與臨近編碼基因的關(guān)系后發(fā)現(xiàn) lncRNAs傾向于與臨近編碼基因共表達(dá)，表明lncRNAs可能調(diào)控臨近基因。當(dāng)使用模型分析lncRNAs特異性后，發(fā)現(xiàn)lncRNAs在腦發(fā)育過程中的表達(dá)特異性受到發(fā)育階段特異的染色質(zhì)修飾調(diào)控，例如H3K4me1和H3K36me3，但并未發(fā)現(xiàn)受到基因組特征調(diào)控，表明LASSO模型具有腦發(fā)育過程特異 lncRNAs的識別能力。原位雜交結(jié)果驗(yàn)證了隨機(jī)挑選的lncRNAs的腦發(fā)育特異性，而半定量RT-

7、PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育階段特異表達(dá)的lncRNAs傾向于具有腦組織特異性。
　　再次，目前公共數(shù)據(jù)庫中 lncRNAs的數(shù)目較少，于是整合基于大規(guī)模的RNA-Seq數(shù)據(jù)預(yù)測的lncRNAs和已知lncRNAs注釋，從而識別出了約26萬個lncRNA轉(zhuǎn)錄本，稱之為 lncRNA合集。其中新 lncRNAs占75％，暗示大部分小鼠lncRNAs尚未被報道。分析發(fā)現(xiàn)該合集中新lncRNAs具有腦器官特異性，但沒有發(fā)育階段特異性。對新ln

8、cRNAs和已知轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)了57個模塊，其中對腦組織表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本模塊進(jìn)行的表達(dá)譜熱圖和GO生物學(xué)過程富集分析表明腦模塊中腦特異基因的富集，為功能注釋奠定基礎(chǔ)?；陔S機(jī)化實(shí)驗(yàn)確定的共表達(dá)閾值，篩選了12548個預(yù)測的具有功能的lncRNAs，其中包括3128個預(yù)測的腦功能相關(guān)的lncRNAs。進(jìn)一步利用牽連獲罪（guilt by association）方法預(yù)測新 lncRNAs的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)測出功能的新 lnc

9、RNAs數(shù)量比基于加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的方法的數(shù)量多1倍，并且注釋的功能條目數(shù)目要多2倍以上，突出了這種方法在預(yù)測lncRNAs功能方面的作用。基于交叉證實(shí)和獨(dú)立測試數(shù)據(jù)的檢驗(yàn)初步證明牽連獲罪方法的有效性。
　　最后，對lncRNA合集中腦表達(dá)的lncRNAs進(jìn)行篩選，得到約246464個lncRNAs。對這些 lncRNAs進(jìn)行基因組和功能基因組注釋，發(fā)現(xiàn)已知基因注釋僅能覆蓋不足1/3的lncRNAs；而幾乎所有的lncRNAs都可以

10、通過Entrez Gene ID得以在基因組定位，因此 lncbrain注釋平臺中可以通過該 ID進(jìn)行 lncRNAs查詢。對lncRNAs的注釋存儲在建立的lncbrain注釋平臺中，該平臺具有較優(yōu)的平臺設(shè)計架構(gòu)及可視化界面，可對查詢進(jìn)行流暢的響應(yīng)。平臺中除了有預(yù)先計算好的基因組注釋，還有支持使用者實(shí)時的表觀基因組和功能基因組分析模塊。此外，本文還對lncbrain平臺的使用進(jìn)行了詳細(xì)的介紹。
　　綜上所述，本文篩選了大量的腦表