高通量結(jié)構(gòu)光層析雙色熒光小鼠全腦成像方法研究.pdf

1、大腦是我們身體中最為神秘的器官，也是我們思想、認知、情感、記憶的來源。大腦中包含數(shù)量極為龐大的神經(jīng)元，這些神經(jīng)元互相連接構(gòu)成了極為復雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。這個神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是腦功能實現(xiàn)的基礎(chǔ)，而我們卻對它知之甚少。要理解大腦的工作機制，我們需要獲得完整神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)。高通量的光學成像方法在對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)成像方面起到了至關(guān)重要的作用。但是已有的光學全腦成像技術(shù)存在諸多限制，高分辨的成像方法通量較低，而且沒有為神經(jīng)元定位提供細胞構(gòu)筑背景。為此，本文提出了一套

2、基于結(jié)構(gòu)光切片技術(shù)的高通量雙色小鼠全腦成像方法，目的在于建立能夠快速、高分辨地同時獲取神經(jīng)元三維形態(tài)結(jié)構(gòu)以及共定位細胞構(gòu)筑背景的全腦成像技術(shù)方案。
　　首先本文提出了高通量全腦光學成像與定位單神經(jīng)元的實現(xiàn)方案。利用寬場并行探測的特點提高數(shù)據(jù)采集通量，使用樣本塊表面成像的方式實現(xiàn)全腦光學成像，通過分離成像和切削過程，提升了全腦成像的穩(wěn)定性，也有利于成像速度的進一步提升。同時，為了解決厚組織塊寬場成像的背景熒光干擾，提出使用光吸收劑來

3、抑制樣本塊底層的熒光信號，降低了厚組織背景熒光對寬場成像質(zhì)量的影響。采用結(jié)構(gòu)光層析方法，實現(xiàn)了高分辨率的三維成像。為了實現(xiàn)神經(jīng)元的準確定位，在成像中提供共定位的細胞構(gòu)筑背景，對常用核酸染料在樹脂包埋腦組織上的細胞復染性能進行了測試，發(fā)展了在樣本塊表面成像過程中對樣本塊表面進行實時細胞胞體復染的方法。
　　為了充分發(fā)揮結(jié)構(gòu)光成像技術(shù)并行探測的高通量優(yōu)勢，研究了在不影響成像分辨率的前提下，提升結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡成像速度的方案。從結(jié)構(gòu)光實

4、現(xiàn)光學切片的原理出發(fā)，分析了影響成像分辨率、信噪比的因素，指出傳統(tǒng)實現(xiàn)結(jié)構(gòu)照明的灰度調(diào)制方法是限制結(jié)構(gòu)光成像速度的關(guān)鍵性因素。從提高光場的調(diào)制速度和調(diào)制效率出發(fā)，提出使用二值調(diào)制的方式產(chǎn)生結(jié)構(gòu)照明圖案。結(jié)合數(shù)字微鏡陣列與科學級互補金屬氧化物半導體探測器，實現(xiàn)了快速的結(jié)構(gòu)光層析成像，大幅提升了結(jié)構(gòu)光顯微成像的速度，使得成像通量較現(xiàn)有技術(shù)提升了一個數(shù)量級。
　　最后，本文研制了一套結(jié)構(gòu)光照明熒光光學切片斷層成像系統(tǒng)（structure

5、d illumination fluorescence micro optical sectioning tomography, SI-fMOST），整合了快速結(jié)構(gòu)光顯微成像以及薄切片子系統(tǒng)。提出一種并行的結(jié)構(gòu)光成像數(shù)據(jù)重建及壓縮方法，實現(xiàn)高通量雙通道數(shù)據(jù)的實時重建及存儲。設(shè)計并實現(xiàn)了系統(tǒng)的采集控制軟件，能夠進行全腦數(shù)據(jù)自動采集。對雙色成像系統(tǒng)的關(guān)鍵部件進行了校準，測量了成像的關(guān)鍵參數(shù)，保證了成像數(shù)據(jù)的質(zhì)量以及自配準的特性?；谔K丹黑B

6、-GMA（Glycol Methacrylate）樹脂包埋的Thy1-eGFP-M轉(zhuǎn)基因小鼠鼠腦，使用SI-fMOST獲取了一套單神經(jīng)元分辨的雙色全腦數(shù)據(jù)集，首次得到了來自同一只小鼠全腦的包括神經(jīng)元精細形態(tài)與共定位細胞構(gòu)筑背景的完整高分辨率全腦數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)采集總共耗時77小時，充分證明了SI-fMOST系統(tǒng)高通量的特性。利用該數(shù)據(jù)集，展示了鼠腦桶狀皮層處單個功能柱內(nèi)的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的三維重建結(jié)果，證明了SI-fMOST系統(tǒng)在神經(jīng)生物學研究中的