高通量篩選吸煙人群中肺癌相關蛋白的研究.pdf

1、背景：肺癌是目前發(fā)達國家乃至全世界危害最為嚴重的惡性腫瘤之一。在我國，肺癌患者每年以26％的速度增長，每年死亡人數(shù)高達60萬之多。目前一致公認，肺癌與吸煙的關系最為密切。我國現(xiàn)擁有全世界1/3的煙民，80％的男性肺癌和19.3％的女性肺癌都歸因于吸煙，所以降低肺癌的發(fā)病率和死亡率已成為迫切需要解決的問題。而能否早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷肺癌成為提高肺癌患者生存率的關鍵問題。近年來已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤標志物可用于肺癌的早期診斷，但是專門針對于吸煙人群的

2、肺癌腫瘤標志物的發(fā)現(xiàn)卻很少。本實驗致力于應用蛋白芯片篩選吸煙人群中的肺癌特異性噬菌體克隆，為將來構建診斷芯片從而篩選相關腫瘤標志物奠定基礎。
　　方法：用RNeasy Mini Kit提取吸煙型肺癌組織的總 RNA，分離純化 mRNA，逆轉錄合成雙鏈 cDNA，經末端修飾、定向 EcoRI/HindIII接頭連接、接頭消化，使其兩端分別帶有 EcoRI和HindIII粘性末端。用Mini Column分離 cDNA片段，收集250

3、 bp以上的雙鏈 cDNA，與T7Select10-3載體連接，體外包裝后，得到吸煙型肺癌組織 T7噬菌體展示 cDNA文庫。然后將構建的噬菌體文庫進行生物淘洗，并用吸煙型肺癌患者血清、非吸煙型正常人血清和吸煙型正常人血清分別對淘洗后的文庫進行大規(guī)模的篩選，對所得數(shù)據(jù)標準化處理，并分別對吸煙肺癌組和非吸煙正常組、吸煙正常組和非吸煙正常組做 t檢驗，以P<0.01為差異極顯著，再結合線性回歸分析，在吸煙肺癌組和吸煙正常組中都高表達，而在非

4、吸煙正常組中低表達的噬菌體克隆即為所需的吸煙人群中肺癌相關克隆。
　　結果：構建的吸煙型肺癌組織 T7噬菌體 cDNA文庫，經測定，原庫庫容為1.35×106 pfu，擴增后文庫滴度為4.4×1010 pfu/ml。PCR鑒定從原始文庫中隨機挑取的100個噬菌斑，重組率為97％，重組體中91％的插入片段長度>250 bp。經所建文庫與蛋白芯片結合篩選噬菌體克隆，對吸煙肺癌組和非吸煙正常組進行分析，篩選出158個在吸煙肺癌組中高表達