利用Hi-C技術(shù)高通量篩選介導(dǎo)染色質(zhì)相互作用的lncRNAs.pdf

1、細(xì)胞核是真核生物特有的，最大的細(xì)胞器。染色質(zhì)是遺傳和表觀遺傳信息的載體，并且是最大的生物大分子。大約2m長(zhǎng)的染色質(zhì)被折疊進(jìn)直徑小于10μm的細(xì)胞核。染色體構(gòu)象捕獲（3C）技術(shù)以及一系列它的衍生技術(shù)（4C、5C、Hi-C）的發(fā)展促進(jìn)了核結(jié)構(gòu)的研究。這些技術(shù)揭示了一些蛋白如CTCF，Cohesin等在染色質(zhì)折疊和相互作用中發(fā)揮重要的作用。最近發(fā)現(xiàn)一些lncRNAs也參與了染色質(zhì)的相互作用。lncRNAs通過(guò)與DNA、蛋白質(zhì)，甚至與RNA本身

2、相互作用，參與了染色質(zhì)相互作用并調(diào)控了核結(jié)構(gòu)的形成，比如XIST,Firre等。因?yàn)榛蚪M的大部分編碼為ncRNA，我們猜測(cè)也許很多l(xiāng)ncRNA參與了核結(jié)構(gòu)的調(diào)控。但是直到現(xiàn)在，也沒(méi)有任何系統(tǒng)的關(guān)于lncRNA參與染色質(zhì)相互作用的報(bào)道。
　　為了在全基因組范圍內(nèi)篩選可能參與染色質(zhì)相互作用的lncRNAs，我們建立了一種基于Hi-C技術(shù)的高通量篩選的方法，它是通過(guò)對(duì)比RNase處理前后基因組范圍的染色質(zhì)相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。建立高質(zhì)量的

3、Hi-C文庫(kù)是整個(gè)課題的關(guān)鍵。Hi-C技術(shù)是一個(gè)多步驟、耗時(shí)較長(zhǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)，需要多種試劑和儀器。這個(gè)技術(shù)還不是很成熟，到現(xiàn)在為止它的重復(fù)性還不是很好很穩(wěn)定。通過(guò)優(yōu)化復(fù)雜的Hi-C實(shí)驗(yàn)中最核心的步驟如交聯(lián)、酶切、限制性內(nèi)切酶的失活和原位連接等，我們建立了一個(gè)成熟的、穩(wěn)定的Hi-C建庫(kù)流程。在初始Hi-C文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增之后，將GM12878細(xì)胞的RNase處理前后的兩組生物學(xué)重復(fù)Hi-C文庫(kù)進(jìn)行了高通量測(cè)序。在初步的生物信息學(xué)分析之后，

4、文庫(kù)的質(zhì)量及生物學(xué)重復(fù)的重復(fù)性得到檢驗(yàn)。平均來(lái)說(shuō)，原始數(shù)據(jù)中大概有90％的比對(duì)率，72%的配對(duì)率。
　　此外，在去除自連片段和dangling-ends后，能夠獲得超過(guò)96%的有效相互作用對(duì)。相關(guān)性分析顯示，兩組生物學(xué)重復(fù)的bincoverage和allbinpairs的相關(guān)性都極強(qiáng)。所有這些結(jié)果進(jìn)一步證明了優(yōu)化了的Hi-C建庫(kù)流程是可靠并且穩(wěn)定的。在獲得了高質(zhì)量并且高度重復(fù)性的文庫(kù)后，我們進(jìn)一步對(duì)照分析了RNase處理前后樣品文

5、庫(kù)的結(jié)果。對(duì)比分析顯示，在RNase處理之后很多相互作用減弱甚至是消失了。
　　在建庫(kù)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，和RNase處理組相比，同樣細(xì)胞量的正常組得到了1.58倍的初始Hi-C文庫(kù)（相互作用片段）。在兩組生物學(xué)重復(fù)的正常組和RNase處理組扣減后，我們選擇正值前10000對(duì)差異相互作用進(jìn)行下一步的分析。最后發(fā)現(xiàn)在RNase處理后消失或減弱的染色質(zhì)相互作用位點(diǎn)附近存在4081個(gè)lncRNAs編碼基因。GO注釋顯示，這4081個(gè)lncRN