高通量篩選腫瘤預防藥物技術平臺的建立及中醫(yī)藥應用研究.pdf

1、“應用天然或人工合成的化合物去阻斷、逆轉或預防侵襲性腫瘤的發(fā)生”，即腫瘤的化學預防(Chemoprevention)。國際癌癥中心曾指出，在復雜多樣的致癌因素中，80％～90％的人類腫瘤是由化學致癌物引起的?；瘜W致癌物可損傷細胞DNA，使基因發(fā)生突變，從而引起腫瘤。腫瘤預防研究的目的之一就是尋找高效、低毒的藥物。由于化學藥品的毒副作用以及人們認識到“回歸大自然”的重要性，天然藥物在腫瘤預防中所起到的作用，日益受到重視。我國有著寶貴、豐富

2、的中藥資源，如何高通量地從中藥中篩選出預防腫瘤的有效成分，己成為一個迫切需要解決的瓶頸問題。
　　 目前，國內(nèi)外應用于藥物篩選的模型大致分為三類：整體動物水平模型、組織器官水平模型和細胞分子水平模型。前兩種模型往往消耗樣品量大，要使用大量的實驗動物，勞動強度高，耗時耗力，并且一次試驗篩選樣品量有限，不適合成分復雜的中藥有效活性成分的篩選。細胞分子水平的藥物篩選模型具有材料用量少、省時高效、藥物作用機制比較明確、可實現(xiàn)大規(guī)模的篩選

3、等特點，但在分子和細胞水平上對化學預防劑的有效鑒別的研究還相當缺乏，通過建立轉基因細胞模型對預防腫瘤中藥進行高通量篩選的研究，國內(nèi)外均未見報道。
　　 本研究旨在建立一種簡便易行、高度敏感和高效率的篩選腫瘤預防藥物的細胞模型，并用于從現(xiàn)有中藥中篩選預防腫瘤的有效成分。
　　 1.應用重組PCR技術，以質(zhì)粒pRL-TK為模板，獲得重組TK啟動子，并在其基本啟動子上游引入SacⅠ酶切位點。將TK啟動子片段克隆入pMD18-T

4、載體中，構建載體pMD-TK。用SalⅠ和BamHⅠ對質(zhì)粒pMD-TK和pEGFP進行雙酶切，將TK啟動子連接到載體pEGFP中構建載體pTK-GFP。再以質(zhì)粒pTK-GFP為模板擴增TK目的片段，用VspⅠ和BamHⅠ對擴增出的TK目的片段和載體pEGFP-N1進行酶切，將TK啟動子連接到載體pEGFP-N1上，構建真核報告載體pTK-GFP/neo。人工合成的4個ARE序列，經(jīng)退火磷酸化后逐個連接到載體pTK-GFP/neo上。首次

5、在國內(nèi)分別構建了真核報告載體pARE-TK-GFP/neo、p2ARE-TK-GFP/neo、p3ARE-TK-GFP/neo和p4ARE-TK-GFP/neo。
　　 2.真核報告載體pTK-GFP/neo、pARE-TK-GFP/neo、p2ARE-TK-GFP/neo和p4ARE-TK-GFP/neo用脂質(zhì)體轉染HepG2細胞，24 h后在熒光顯微鏡下觀察到4種細胞都發(fā)出綠色熒光，說明啟動子的選擇是較為合適的。接著用600

6、μg/mLG418篩選出陽性細胞克隆。首次在國內(nèi)構建了無ARE調(diào)控的細胞模型HepG2-TK-GFP和不同ARE重復序列調(diào)控的細胞模型HepG2-ARE-TK-GFP、HepG2-2ARE-TK-GFP、HepG2-3ARE-TK-GFP和HepG2-4ARE-TK-GFP。
　　 3.HepG2-TK-GFP、HepG2-ARE-TK-GFP、HepG2-2ARE-TK-GFP和HepG2-4ARE-TK-GFP細胞擴增后，經(jīng)

7、胰酶消化，接種入黑色96孔細胞培養(yǎng)板，每孔細胞數(shù)為5×104個，培養(yǎng)24 h后，除對照孔外，各孔加入終濃度為100μM的tBHQ，并設5個重復。24小時后用PBS洗滌，再加入100μg/mL EB200μL室溫下染色20 min，再用PBS洗滌1次后加入200μL PBS，用多功能熒光酶標儀檢測細胞的GFP和EB熒光強度，求其相對發(fā)光度。結果HepG2-4ARE-TK-GFP細胞的GFP誘導表達水平最高，為HepG2-TK-GFP細胞的

8、6倍，選用該細胞中對GFP具有最高表達水平和最低基礎水平的克隆做后續(xù)實驗。
　　 4.將HepG2-TK-GFP和HepG2-4ARE-TK-GFP細胞擴增后，接種入黑色96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度(0(DMSO對照)、12.5、25、50、100、200μM)的陽性受試物PDTC和tBHQ。每濃度設5個重復，作用24 h后用PBS洗滌，加入EB染色，用多功能熒光酶標儀檢測細胞的GFP和EB熒光強度。結果顯示PD

9、TC和tBHQ對HepG2-TK-GFP細胞的GFP熒光均無誘導作用，其熒光強度呈不規(guī)則變化，各濃度組之間差異不顯著(P＞0.05)；PDTC誘導的HepG2-4ARE-TK-GFP細胞中的GFP熒光隨著PDTC濃度的升高，熒光表達水平呈先上升后下降的趨勢，具有一定的劑量效應關系。在濃度為50μM時誘導效果最好，與對照組比較差異有顯著性(P＜0.05)；tBHQ誘導的HepG2-4ARE-TK-GFP細胞中的GFP熒光隨著tBHQ濃度的

10、升高，熒光表達水平持續(xù)上升，各組(12.5，25，50，100，200μM)與對照組比較差異都有顯著性(P＜0.05)，且具有一定的劑量效應關系。從而證實本實驗所構建的這種轉基因細胞模型可用來篩選不同結構性質(zhì)的化學預防劑。
　　 5.以質(zhì)粒pDsRed2-N1為模板擴增紅色熒光蛋白及啟動子片段克隆入載體pMD18-T上，構建載體pMD-DsRed。用AdeⅠ和BspTⅠ對載體pMD-DsRed和p4ARE-TK-GFP/neo進

11、行雙酶切，將目的紅色熒光蛋白及啟動子片段連接到載體p4ARE-TK-GFP/neo上，構建真核報告載體p4ARE-TK-GFP/DsRed/neo。該載體用脂質(zhì)體轉染HepG2細胞，并用G418篩選出陽性細胞克隆。首次構建了以GFP為第一信號，以紅色熒光蛋白為第二信號的細胞模型HepG2-4ARE-TK-GFP/DsRed。將該細胞接種入黑色96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度(0(DMSO對照)、12.5、25、50、100、20

12、0μM)的陽性受試物PDTC和tBHQ。所得結果與HepG2-4ARE-TK-GFP細胞模型中的結果基本一致，證實對轉基因細胞模型HepG2-4ARE-TK-GFP的完善是成功的，使篩選更簡單、更方便、更準確。
　　 6.首次利用HepG2-4ARE-TK-GFP細胞模型對22種中藥單體、3種中藥有效部位、復方六味地黃膠囊、四君子湯以及組成兩方的各單味中藥的提取物進行了篩選，結果中藥單體中穿心蓮內(nèi)酯、黃芩苷、大黃酸、大黃素、槲皮

13、素、大豆苷元、熊果酸、白藜蘆醇顯示結果為陽性，且都具有一定的劑量效應關系，提示8種單體能誘導Ⅱ相酶表達起到化學預防作用；三種有效部位中半枝蓮總黃酮注射液和黃芪注射液顯示結果為陽性，提示其阻斷癌前病變和抗突變的作用可能是通過誘導Ⅱ相酶表達實現(xiàn)的；復方六味地黃膠囊和四君子湯的顯示結果為陽性，單味中藥提取物中熟地黃、人參、白術顯示結果為陽性。其中復方六味地黃膠囊效果優(yōu)于該方中的單味中藥熟地黃，提示其誘導效果可能是因為復方產(chǎn)生了新的成分或是各成