魚類Sox30和Sox6的克隆、表達(dá)及其在性腺發(fā)育中作用的初步研究.pdf

1、Sox轉(zhuǎn)錄因子家族成員是一類與哺乳動(dòng)物雄性性別決定基因Sry相關(guān)的高度保守的基因。該家族成員共有的特征是具有一個(gè)約79個(gè)氨基酸且可與DNA特異結(jié)合的高遷移率組盒區(qū)(HMG-box)。與哺乳動(dòng)物Y染色體上Sry的HMG-box相比，Sox成員對(duì)應(yīng)的氨基酸組成至少有50％的同源性。迄今，在大多數(shù)脊椎動(dòng)物已確定了大約20個(gè)Sox成員，該基因家族在進(jìn)化過程中相當(dāng)保守，并且大部分Sox基因都廣泛參與了脊椎動(dòng)物的發(fā)育過程，包括性別決定與分化。

2、>　　 Sox30和Sox6被認(rèn)為是參與脊椎動(dòng)物性別分化的重要Sox成員。然而，到目前為止，Sox30僅在哺乳類和鳥類中克隆獲得，沒有關(guān)于在魚類存在該基因的相關(guān)報(bào)道，且有學(xué)者甚至認(rèn)為Sox30在低等脊椎動(dòng)物可能是不存在的；Sox6已在人、小鼠和大鼠等少數(shù)物種中克隆，在硬骨魚類，只在虹鱒、斑馬魚中克隆得到1個(gè)Sox6/lz(Soxlz就是Sox6)和在東方鲀的基因組中分離得到2種不同的Sox6(Sox6a和Sox6b)。而且，Sox30

3、和Sox6在脊椎動(dòng)物性別分化中的具體功能和作用機(jī)制現(xiàn)在尚不清楚。
　　 為進(jìn)一步確定Sox30在低等脊椎動(dòng)物尼羅羅非魚中是否存在，如果存在，該基因在其性別分化中具有怎樣的功能。另外，為闡明Sox6在羅非魚性別分化過程中的作用。本研究通過RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)和RACE(rapid amplification of cDNA ends)相結(jié)合的

4、方法，從羅非魚克隆獲得了Sox30的4種cDNA、Sox30基因編碼區(qū)以及Sox6a和Sox6b的cDNA序列。應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Sox30編碼區(qū)包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，并且由于選擇性剪切可能全少存在4種轉(zhuǎn)錄本，分別被命名為AS-Ⅰ到AS-Ⅳ；Sox6a和Sox6b編碼區(qū)均包含14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子。通過對(duì)基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，和哺乳類、鳥類一樣，Sox30在兩棲動(dòng)物爪蟾、脊索動(dòng)物海鞘(Sox30也稱為SoxH

5、)和文昌魚中同樣存在，而在無脊椎動(dòng)物不存在，表明Sox30可能是伴隨脊索動(dòng)物的出現(xiàn)而出現(xiàn)的新基因；與東方鲀相同，在河鲀、青鳉中Sox6也存在2個(gè)平行同源基因(paralogous genes)。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，羅非魚Sox30與其它已經(jīng)克隆或分離到的Sox30/H聚于同一進(jìn)化枝；與東方鲀、河鲀相同，羅非魚Sox6a和Sox6b聚于兩個(gè)不同進(jìn)化枝。這些結(jié)果表明Sox30/H普遍存在于整個(gè)脊索/脊椎動(dòng)物；Sox6a和Sox6b廣泛存在

6、于硬骨魚類，進(jìn)一步支持硬骨魚類經(jīng)歷了一次特有基因組復(fù)制的理論。將羅非魚Sox30、Sox6a和Sox6b與所有已被克隆或分離的脊索或脊椎動(dòng)物相應(yīng)基因序列分別進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示Sox30在除HMG-box外的區(qū)域保守性非常低，即便存HMG-box物種間的相似性也只有50％左右；Sox6a和Sox6b的保守性則非常高，分別達(dá)到88％和78％，在HMG-box區(qū)域更高，相似性都超過90％。同時(shí)序列對(duì)比還發(fā)現(xiàn)羅非魚Sox30、Sox6a和

7、Sox6b都比其它物種的相應(yīng)基因編碼的氨基酸序列短了一段。此外，為了弄清楚Sox基因的進(jìn)化歷史和各成員間的相互關(guān)系，本研究還對(duì)Sox基因家族進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)生分析，分析結(jié)果支持Sox基因被劃分為10個(gè)不同亞族即從A到J亞族和該基因家族成員的增加是通過單個(gè)祖先基因擴(kuò)展成多個(gè)相關(guān)基因的論斷。同時(shí)，本研究還根據(jù)Sox基因成員在系統(tǒng)發(fā)生分析中的確切位置對(duì)脊椎動(dòng)物中某些命名不正確的成員進(jìn)行了更正。
　　 通過RT-PCR分析成體(8月齡)羅非

8、魚各組織的分布發(fā)現(xiàn)，Sox30的4種亞型只在性腺特異表達(dá)，在其他組織未檢測到表達(dá)，而Sox6a和Sox6b則不僅在性腺表達(dá)，也在其它多種組織廣泛表達(dá)，并且三者在性腺的表達(dá)都呈現(xiàn)明顯的性別二態(tài)型：就Sox30而言，AS-Ⅰ在精巢中的表達(dá)量明顯高于卵巢，與AS-Ⅰ相反，AS-Ⅳ在卵巢的表達(dá)水平卻高于精巢，而AS-Ⅱ是精巢特異性表達(dá)的亞型；對(duì)Sox6來說，Sox6a在精巢中表達(dá)量較高，而Sox6b則在卵巢中表達(dá)水平較高。
　　 個(gè)體發(fā)

9、生結(jié)果表明，Sox30、Sox6a和Sox6b都在性腺發(fā)育的較早時(shí)期就開始表達(dá)：Sox30開始表達(dá)于孵化后10天(days after hatching，dah)，早于羅非魚性腺的組織學(xué)形態(tài)分化期(大約為25dah)，其中AS-Ⅱ從90dah開始直到成體均出現(xiàn)雄性性腺特異性表達(dá)，驗(yàn)證了組織分布中該亞型僅在雄性性腺表達(dá)的結(jié)果；有意思的是AS-Ⅲ只在10dah的雄性性腺特異表達(dá)，在其他時(shí)期均未檢測到表達(dá)；而AS-Ⅰ和AS-Ⅳ不僅表達(dá)于雄性性

10、腺，也在雌性性腺中表達(dá)，而且AS-Ⅰ在10、15dah時(shí)表現(xiàn)為雌性性腺特異表達(dá)。Sox6a和Sox6b則在5dah時(shí)(此時(shí)為羅非魚性別決定的關(guān)鍵期)的性腺就已開始表達(dá)，且在5dah時(shí)Sox6b只在雄性性腺表達(dá)。
　　 在性逆轉(zhuǎn)成體性腺中，Sox30的3種選擇性剪切亞型都表現(xiàn)出明顯的與表型性別相關(guān)的表達(dá)模式，AS-Ⅱ僅在正常XY(())和性逆轉(zhuǎn)XX(())中表達(dá)，與組織分布、個(gè)體發(fā)生中該亞型為雄性特異表達(dá)的結(jié)果相一致；AS-Ⅰ在性

11、逆轉(zhuǎn)XY(♀)比較正常XY(())性腺表達(dá)下調(diào)，而在性逆轉(zhuǎn)的XX(())相對(duì)正常XX(♀)性腺則表達(dá)上調(diào)，該結(jié)果與先前得到的AS-Ⅰ在精巢中的表達(dá)量較高一致；在性逆轉(zhuǎn)XY(♀)AS-Ⅳ表達(dá)上調(diào)，也與先前得到的AS-Ⅳ在卵巢中的表達(dá)量較高結(jié)論一致，不過在性逆轉(zhuǎn)的XX(())性腺AS-Ⅳ卻沒有出現(xiàn)明顯的表達(dá)變化。
　　 通過原位雜交進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Sox30(由于無法設(shè)計(jì)合成區(qū)別每種亞型的探針，因此本研究選用的是能夠雜交4種Sox3

12、0亞型mRNAs的探針)在10dah時(shí)雄性性腺的生殖細(xì)胞和雌性性腺的體細(xì)胞表達(dá)，而先前的個(gè)體發(fā)生揭示，在10dah時(shí)雄性性腺只存在AS-Ⅲ的表達(dá)，而雌性性腺僅表達(dá)AS-Ⅰ，因此認(rèn)為此時(shí)在雄性性腺生殖細(xì)胞表達(dá)的信號(hào)來自于AS-Ⅲ，在雌性性腺體細(xì)胞表達(dá)的信號(hào)則源自AS-Ⅰ；Sox30在4個(gè)月時(shí)精巢中精子和卵巢中間質(zhì)細(xì)胞及7個(gè)月時(shí)精巢中精子和卵巢的鞘膜、顆粒細(xì)胞表達(dá)，而在相應(yīng)時(shí)期的精巢同時(shí)存在AS-Ⅰ、AS-Ⅱ和AS-Ⅳ的表達(dá)，在卵巢也存在A