SOX2在肺癌發(fā)生和細(xì)胞凋亡中作用機(jī)制的研究.pdf

1、在世界范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率呈持續(xù)增高的趨勢并且居男女腫瘤病死率的首位。據(jù)統(tǒng)計2009和2010年，在所有腫瘤中肺癌的發(fā)病率和病死率仍然最高[1-2]，大部分的肺癌病人在初次確診時已經(jīng)處于癌癥的晚期，因此造成了肺癌的高病死率[3]。2011年美國有221，130例新發(fā)肺癌病人以及有156，940例肺癌病人死亡[4]。在病理分型上，肺癌被劃分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(腺癌、鱗癌和大細(xì)胞肺癌)，這一病理分型為治療策略的選擇和預(yù)后的評判提供參

2、考的依據(jù)。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌的比例超過85％，在初次確診時大多數(shù)病人的原位腫瘤已經(jīng)為晚期并伴有腫瘤轉(zhuǎn)移，而其中肺腺癌占非小細(xì)胞肺癌約60%-70%的比例。手術(shù)切除腫瘤是對于早期非小細(xì)胞肺癌治療的主要手段[5]，而對于不能手術(shù)切除腫瘤的病人，通常采用放療和化療的辦法。對于小細(xì)胞肺癌而言化療是主要的治療方式，對一些處于特定臨床分期的腫瘤也采取合并放療的方式[5]。許多研究表明在小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌中都存在腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞[

3、6-26]。這些肺癌干細(xì)胞具有高克隆形成性，可以形成腫瘤并且對化療放療都具有抵抗性。與其他許多癌癥類似，肺癌的發(fā)病也由于癌基因的激活，或抑癌基因的失活[27]。肺癌細(xì)胞的異常生長是一個多基因參與，涉及復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的過程，然而基因參與腫瘤生長并且在肺癌干細(xì)胞中的分子調(diào)控機(jī)制并不明確。因此，對肺癌分子調(diào)控機(jī)制的深入研究可提高肺癌病人的治療質(zhì)量。
　　 性別決定區(qū)域Y基因2(sex determining region Y-bo

4、x2，SOX2)，參與維持胚胎干細(xì)胞的多能性[28-29]，并且在多種器官發(fā)育過程中發(fā)揮作用，包括參與肺支氣管的形成[30]。在腫瘤基因表達(dá)的研究中，分析在發(fā)育和分化中激活的基因結(jié)果表明，SOX2在低分化的腫瘤中高表達(dá)[31-32]。
　　 本文以SOX2為研究對象，通過各種實(shí)驗(yàn)手段，一方面闡明了SOX2分子在肺癌發(fā)生中的重要作用，參與調(diào)控肺癌干細(xì)胞生長及其調(diào)節(jié)的分子機(jī)制。另一方面，在觀察到沉默SOX2分子可引起肺癌細(xì)胞發(fā)生顯著

5、凋亡的基礎(chǔ)上，進(jìn)而深入的研究了其調(diào)控凋亡的分子機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)為我們研制以SOX2為靶點(diǎn)的可應(yīng)用于肺癌治療的有效藥物奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 首先，我們利用免疫組織化學(xué)染色的方法，對臨床肺癌和正常肺組織標(biāo)本進(jìn)行了染色，分析SOX2在肺癌臨床標(biāo)本中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)SOX2在肺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常的肺組織，這一結(jié)果提示我們，SOX2在肺癌的發(fā)生中起重要的作用。
　　 其次，我們利用Hoechst33342對A549細(xì)胞進(jìn)

6、行染色并經(jīng)過流式細(xì)胞儀分選，分析SOX2在人肺癌細(xì)胞A549的側(cè)群細(xì)胞中的表達(dá)，在RNA和蛋白水平都檢測出SOX2的表達(dá)在側(cè)群細(xì)胞中明顯高于非側(cè)群細(xì)胞，說明SOX2在維持肺癌干細(xì)胞的特性中發(fā)揮了重要的作用。
　　 通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們初步明確了SOX2在肺癌發(fā)生和維持肺癌干細(xì)胞特性中的作用。我們進(jìn)一步通過慢病毒系統(tǒng)建立了可經(jīng)Doxycycline誘導(dǎo)沉默SOX2的穩(wěn)定細(xì)胞系，并運(yùn)用NOD/SCID免疫缺陷小鼠建立了肺癌體內(nèi)模型

7、，探討了SOX2在肺癌發(fā)生和凋亡中的作用及其分子機(jī)制。
　　 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.沉默SOX2可顯著下調(diào)A549細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞的比例，并且導(dǎo)致在側(cè)群細(xì)胞中高表達(dá)的癌基因WNT1、WNT2、NOTCH1和c-MYC的表達(dá)量都明顯下降，這一分子調(diào)控的變化在另一株人肺癌細(xì)胞系H460中可得到相同的結(jié)果，
　　 2.利用體內(nèi)成像系統(tǒng)，連續(xù)動態(tài)的對小鼠體內(nèi)肺癌細(xì)胞生長進(jìn)行觀察，沉默SOX2可顯著抑制肺癌的發(fā)生，并

8、且肺組織切片染色結(jié)果顯示，癌基因WNT1、WNT2、NOTCH1和c-MYC在沉默SOX2實(shí)驗(yàn)組的肺癌組織中的表達(dá)量都明顯下降。
　　 3.通過基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)沉默SOX2可調(diào)控246個癌基因的表達(dá)發(fā)生變化，進(jìn)一步揭示了SOX2在肺癌發(fā)生中的潛在分子機(jī)制。
　　 4.沉默SOX2可引起肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H460和H1299細(xì)胞死亡，通過AnnexinⅤ和PI染色結(jié)果可知細(xì)胞發(fā)生了明顯的凋亡。
　　 5.通過凋

9、亡蛋白芯片分析，結(jié)合Western Blot結(jié)果驗(yàn)證，沉默SOX2引發(fā)的凋亡是通過調(diào)控了凋亡的線粒體途徑和死亡受體途徑共同作用發(fā)生的，并且SOX2調(diào)控表達(dá)變化最為顯著的蛋白是p53的表達(dá)和磷酸化水平的上調(diào)、Bax和Bad分子的表達(dá)增加，caspase3和caspase8分子的激活。
　　 6.Real-time PCR和Western Blot結(jié)果顯示，沉默SOX2可引起RAS/MAP激酶通路的分子表達(dá)量上調(diào)，并且激活凋亡通路中

10、的兩個重要的誘發(fā)因子p53和TNFα，并且下調(diào)Survivin的表達(dá)。
　　 7.在沉默SOX2的同時沉默RAS或MAP4K4分子或者過表達(dá)Survivin都能明顯的抑制凋亡發(fā)生的程度，經(jīng)AnnexinⅤ和PI染色結(jié)果可知，發(fā)生凋亡的細(xì)胞比例明顯下降。
　　 8.對人肺癌組織芯片的免疫組化染色結(jié)果可知，SOX2的蛋白表達(dá)水平與Survivin的表達(dá)水平呈正相關(guān)。
　　 9.小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，沉默SOX2可引起已形

11、成的肺腫瘤細(xì)胞發(fā)生顯著的凋亡，并且引起與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致的p53、Survivin和TNFα表達(dá)量的變化。
　　 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)論如下：
　　 1.SOX2在肺癌發(fā)生和凋亡信號通路中具有重要作用，并且可與Survivin共同作為標(biāo)志物應(yīng)用于腫瘤診斷。
　　 2.SOX2是通過調(diào)控肺癌側(cè)群細(xì)胞中的癌基因的表達(dá)進(jìn)而起到調(diào)控肺癌發(fā)生作用。
　　 3.SOX2調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制是通過調(diào)控RAS-MAP4K4-