斑馬魚核糖核酸酶1和5在胚胎發(fā)育早期的功能研究.pdf

1、斑馬魚（zebrafish，Danio rerio）核糖核酸酶A超家族（RNase A superfamily）由Elio Pizzo等于2006年首次發(fā)現(xiàn)。迄今為止已報道的成員一共有5名，分別被命名為zebrafish RNase1/2/3/4/5(ZF-RNase-1/2/3/4/5)。作為人類血管生成素(humanangiogenin，hANG)的同源基因，它們與hANG在蛋白質(zhì)晶體結構和細胞水平功能學方面有相當高的相似程度。考慮

2、到小鼠體內(nèi)存在6個hANG同源基因和3個假基因，進行hANG功能學研究較為復雜，我們擬用斑馬魚作為體內(nèi)功能研究的動物模型。為此，本文在初略探明斑馬魚胚胎發(fā)育早期ZF-RNases表達情況的基礎上，對2個在該時期顯著表達的成員----ZF-RNase-1和5進行了深入研究，不僅構建了兩者的時空表達模式，還探索了它們在該時期的體內(nèi)生物學功能。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴從AB品系野生型斑馬魚整胚的cDNA中克隆得到ZF-RNases的

3、表達序列(expressed sequence tags，ESTs)，利用半定量PCR(semi-quantitative reversetranscription and PCR，semi-quantitative RT-PCR)的方法明確了5名成員中僅ZF-RNase-1/3/5在斑馬魚胚胎發(fā)育早期顯著表達。在此基礎上，我們利用實時熒光定量PCR(Real-time PCR，qRT-PCR)技術研究了ZF-RNase-1/3/5在受

4、精后0-72小時的時間表達譜。結果顯示，ZF-RNase-1在該時期的表達豐度極低，僅在受精后24小時被特異性上調(diào);ZF-RNase-3/5在該時期的表達水平隨時間逐漸上升，提示ZF-RNase-1/3/5在斑馬魚胚胎發(fā)育早期可能扮演不同角色，且ZF-RNase-1很可能僅參與調(diào)控受精后24小時這一時間點的特定發(fā)育學過程。鑒于已報道的ZF-RNase-3在蛋白質(zhì)晶體結構和體外功能方面與hANG差異比較明顯，而在我們的初步探索中亦未發(fā)現(xiàn)其

5、明顯的體內(nèi)功能（詳見討論6.1），我們將研究重點集中到ZF-RNase-1和5上。
　?、圃浑s交（in situ hybridization）結果顯示，ZF-RNase-1 mRNA主要分布于原初腦和軀干腹側;ZF-RNase-5 mRNA除了分布于以上組織區(qū)域外，還分布于卵黃囊四周。已知在斑馬魚胚胎發(fā)育早期，軀干腹側是主要血管——背主動脈(dorsalaorta，DA)和后主靜脈(posterior cardinal vein

6、，PCV)所在的位置。因此，我們的結果明顯提示這兩個ANG同源基因可能參與對斑馬魚血管系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控，而ZF-RNase-5還可能與卵黃組織的形成或功能息息相關。為深入研究其功能，我們利用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技術獲得了ZF-RNase-1/5的全長cDNA。測序結果顯示，相比于NCBI數(shù)據(jù)庫中的對應序列，本論文得到的ZF-RNase-1的cDNA缺失了整段信號肽序列，而ZF-RNa

7、se-5 cDNA的5'UTR不僅在-1至-104位的序列一致性僅為46％，還在-104位之前多出約170個堿基，提示雖然ZF-RNase-1被歸為斑馬魚核糖核酸酶A超家族，但它可能并非作為傳統(tǒng)認為的分泌蛋白來發(fā)揮作用。
　?、抢媚茉诎唏R魚胚胎中特異性下調(diào)特定基因表達的常用工具——Morpholinos(Morpholino phosphorodiamidate antisense oligonucleotides, MOs)下

8、調(diào)ZF-RNase-1/5的表達水平，期望通過對表達下調(diào)后的胚胎所表現(xiàn)出的缺陷表型研究，初步揭示它們在胚胎發(fā)育早期的不同階段、不同組織中所行使的功能。
　?、壤每蓪崟r觀察和研究斑馬魚血管新生的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系Tg(fli1∶EGFP)y1來探索ZF-RNase-1在胚胎發(fā)育早期血管新生中的功能。我們將特異性靶向ZF-RNase-1的MOs注射入該轉(zhuǎn)基因斑馬魚的單細胞期受精卵的卵黃中，觀察并記錄受精后2天以內(nèi)的血管新生情況。結果顯

9、示，ZF-RNase-1的MOs導致胚胎在受精后36小時表現(xiàn)顯著的體節(jié)間血管(intersegmental vessel，ISV)缺陷，即ISV未延伸至背側頂端并形成背側縱向吻合血管(dorsal longitudinal anastomoticvessel， DLAV);該表型能夠通過補入體外轉(zhuǎn)錄的ZF-RNase-1 mRNA部分挽救。當我們僅注射ZF-RNase-1 mRNA進行過表達時，胚胎表現(xiàn)出顯著的ISV異位生長現(xiàn)象，即IS

10、V延伸至水平肌隔之上、尚未至背側頂端即提前分支，但最終卻在背側頂端形成正常的DLAV。進一步研究表明，ZF-RNase-1表達水平的改變導致了促血管新生的VEGF信號在血管內(nèi)皮細胞膜表面的受體分子----kdrl(kinase insertdomain receptor like，VEGFR2)表達水平的相應變化，而對抑制血管異位生長的Notch信號的配體分子----delta like ligand4(dll4)的表達水平無顯著影響。

11、以上結果表明，ZF-RNase-1通過VEGF信號通路促進了胚胎發(fā)育早期血管新生過程中ISV的生長。
　?、裳芯苛薢F-RNase-5在胚胎發(fā)育早期血管新生及其卵黃延伸體形成和形態(tài)維持上的作用。在Tg(fli1∶EGFP)y1轉(zhuǎn)基因斑馬魚中下調(diào)ZF-RNase-5的表達后，胚胎發(fā)育早期血管新生中的ISV萌芽受到抑制;該表型能夠通過補入體外轉(zhuǎn)錄的ZF-RNase-5 mRNA顯著挽救。此外，這些胚胎還表現(xiàn)出顯著的形態(tài)學特征----卵

12、黃延伸體的缺陷。卵黃延伸體是從胚胎靠近頭部的球形卵黃囊向尾部延伸而形成的圓柱形腹側組織，主要為發(fā)育早期的胚胎軀干部提供營養(yǎng)物質(zhì)。為更直接地研究上述卵黃延伸體的缺陷表型，我們將特異性靶向ZF-RNase-5的MOs注射入AB品系野生型斑馬魚單細胞期受精卵的卵黃中，導致在受精后2-5天胚胎的孵化率和存活率顯著降低，提示ZF-RNase-5對早期胚胎發(fā)育是重要和必要的。在受精后24小時，這些胚胎依然表現(xiàn)出嚴重的卵黃延伸體缺陷，即卵黃延伸體顯著

13、縮小甚至完全缺失;該表型亦能夠通過補入體外轉(zhuǎn)錄的ZF-RNase-5 mRNA部分挽救。進一步，我們通過TUNEL實驗發(fā)現(xiàn)下調(diào)ZF-RNase-5的表達誘導了胚胎卵黃合胞體層中特異性的DNA損傷。以上結果提示，ZF-RNase-5在卵黃延伸體的形成、維持及軀干間的營養(yǎng)物質(zhì)運輸和代謝扮演了關鍵性的角色。在檢測到抑制ZF-RNase-5的表達顯著上調(diào)胚胎體內(nèi)與DNA損傷及細胞凋亡密切相關的p53蛋白水平并激活下游基因p21和Bax表達的基礎

14、上，我們利用p53基因操作和tp53基因DNA結合域突變的轉(zhuǎn)基因斑馬魚tp53M214K進行機制研究。結果顯示，當共注射特異性靶向ZF-RNase-5和p53的MOs后，上述卵黃延伸體的缺陷被顯著地部分挽救;抑制tp53M214K中ZF-RNase-5的表達未引起上述卵黃延伸體的缺陷。以上結果表明，下調(diào)ZF-RNase-5的表達不僅抑制了胚胎發(fā)育早期血管新生中ISV的萌芽，而且顯著上調(diào)了p53的蛋白水平，激活了p53信號通路，誘導了該時

15、期卵黃合胞體層中特異性的DNA損傷，從而引起了嚴重的卵黃延伸體缺陷。
　?、试谌祟愄ケP發(fā)育過程中hANG不僅在蛻膜期的腺上皮細胞、母源血管細胞、巨噬細胞中顯著表達，還可由絨毛外滋養(yǎng)層細胞、絨毛滋養(yǎng)層(extravillous and villous cytotrophoblasts)細胞分泌。本論文結果證明ZF-RNase-5在卵黃組織（亦被稱為假胎盤，與人類胎盤的主要功能相似）中高表達并發(fā)揮了積極作用。因此，我們有理由推測hAN

16、G可能參與調(diào)控了人類胎盤正常形態(tài)或功能的維持。
　?、吮狙芯坎粌H構建了hANG的同源基因----斑馬魚核糖核酸酶A超家族成員ZF-RNase-1和ZF-RNase-5在胚胎發(fā)育早期的時空表達譜，完成了其cDNA全長的測定，還初步揭示了它們在該時期的體內(nèi)生物學功能。其中，ZF-RNase-1通過VEGF信號通路促進了血管新生中ISV的生長;ZF-RNase-5不僅與血管新生中的ISV萌芽相關，而且通過p53信號通路調(diào)控卵黃延伸體形態(tài)