乙醇對(duì)斑馬魚早期胚胎發(fā)育的影響及其分子機(jī)制研究.pdf

1、妊娠期間攝入乙醇對(duì)胚胎發(fā)育有嚴(yán)重影響，胎兒酒精綜合征(FetalAlcoholSyndrome，F(xiàn)AS)是最主要的發(fā)育畸形，表現(xiàn)為頭面部畸形、心血管系統(tǒng)發(fā)育障礙和永久性神經(jīng)系統(tǒng)損傷。許多模式生物用于研究乙醇對(duì)胚胎發(fā)育的影響，但是不同的模式生物各有優(yōu)缺點(diǎn)。斑馬魚作為模式生物，其發(fā)育過程與人類有很高的同源性，并具有發(fā)育周期快、胚體透明等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于發(fā)育遺傳學(xué)和環(huán)境毒理學(xué)的研究。Laale等首先發(fā)現(xiàn)乙醇能引起斑馬魚獨(dú)眼畸形。除此之外，乙

2、醇的致畸作用所表現(xiàn)出的表型十分復(fù)雜，主要還包括心前區(qū)水腫、循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育障礙、體軸發(fā)育回形、雙側(cè)肝臟、前腦發(fā)育畸形等表型，但其具體分子機(jī)制仍然不明。 1.乙醇干擾斑馬魚心血管系統(tǒng)的發(fā)育 先天性心臟病和心血管發(fā)育畸形在FAS患兒中發(fā)生率接近50％，主要表現(xiàn)為房間隔缺損、室間隔缺損、肺動(dòng)脈發(fā)育不全、主動(dòng)脈狹窄。但是由于這些改變大多需要心導(dǎo)管檢查才能診斷，發(fā)現(xiàn)比較困難，因此長(zhǎng)期以來未受到人們重視。我們?cè)诎唏R魚FAS模型中，觀察到

3、乙醇對(duì)斑馬魚心血管系統(tǒng)的發(fā)育有很強(qiáng)的干擾作用。實(shí)驗(yàn)中，用不同濃度的乙醇處理斑馬魚胚胎，發(fā)現(xiàn)能夠干擾其胚胎循環(huán)系統(tǒng)的建立，半數(shù)有效濃度(EC50)為182．5mM。乙醇短暫暴露實(shí)驗(yàn)顯示圓頂期為敏感時(shí)間窗，400mM乙醇短暫暴露3h能夠?qū)е?3％的胚胎產(chǎn)生循環(huán)障礙。我們排除了乙醇對(duì)斑馬魚造血系統(tǒng)影響，通過血管內(nèi)皮細(xì)胞分子標(biāo)記(Flk-1)進(jìn)行原位雜交顯示，乙醇干擾了軀干部體軸血管的建立，而對(duì)頭面部血管沒有影響。用動(dòng)脈和靜脈的分子標(biāo)記(eph

4、rinB2和ephB4)進(jìn)行原位雜交以及半薄切片顯示，乙醇主要干擾斑馬魚背主動(dòng)脈的形成，而對(duì)體軸靜脈沒有明顯影響。進(jìn)一步研究表明，乙醇影響斑馬魚底索的發(fā)育，因缺少底索分泌的Radar和Ang-1等血管形成因子，間接地影響了背主動(dòng)脈的形成和穩(wěn)定。這些結(jié)果為研究乙醇對(duì)人類心血管系統(tǒng)發(fā)育的影響提供了線索。 2．斑馬魚早期胚胎蛋白質(zhì)組學(xué)分析 采用二維凝膠電泳分離斑馬魚受精卵期、圓頂期、胚盾期和5體節(jié)期的胚胎總蛋白。銀染后，通過凝

5、膠掃描儀獲取凝膠圖像，并用ImageMaster2D軟件分析。檢測(cè)出受精卵期間蛋白點(diǎn)226個(gè)，圓頂期蛋白點(diǎn)307個(gè)，胚盾期蛋白點(diǎn)327個(gè)，5體節(jié)期蛋白點(diǎn)574個(gè)。顯示受精卵期至胚盾期蛋白數(shù)量有少量增加，至5體節(jié)期蛋白數(shù)量急劇增加，表明蛋白表達(dá)數(shù)量與形態(tài)學(xué)的變化和器官發(fā)生有密切關(guān)系。48％的早期蛋白點(diǎn)在5體節(jié)期蛋白圖譜中仍然存在，提示母體蛋白質(zhì)對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育起著重要的作用。選取4個(gè)不同發(fā)育階段共有的3個(gè)高豐度蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果為

6、卵黃蛋白的三種不同剪切形式，表明斑馬魚早期胚胎樣品中卵黃生成素豐度較高。本文對(duì)斑馬魚胚胎蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，建立了斑馬魚早期胚胎發(fā)育的二維電泳圖譜，為進(jìn)一步開展斑馬魚功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供重要平臺(tái)。 進(jìn)一步莉用二維電泳分離正常對(duì)照組及乙醇處理組胚胎總蛋白。ImageMaster2DE1ire軟件對(duì)正常和乙醇處理胚胎二維電泳進(jìn)行差異分析，發(fā)現(xiàn)表達(dá)下調(diào)的蛋白點(diǎn)3個(gè)，表達(dá)上調(diào)的蛋白點(diǎn)7個(gè)。質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明這三個(gè)下調(diào)蛋白點(diǎn)

7、分別為前腦菲肽原、TARDNA結(jié)合蛋白和膠原蛋白2a1。這為進(jìn)一步研究乙醇致畸作用的分子機(jī)制提供重要線索。 3．乙醇干擾斑馬魚Nodal信號(hào)通路 我們證明了乙醇導(dǎo)致的體軸發(fā)育障礙是由于乙醇干擾了軸中胚層的發(fā)育，而獨(dú)眼畸形是由于乙醇干擾了前脊索板(prechordalplate)遷移引起的。通過原位雜交證實(shí)了二維電泳的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)乙醇干擾了軸中胚層的細(xì)胞外基質(zhì)——Co12a1的表達(dá)。我們還發(fā)現(xiàn)乙醇能夠影響斑馬魚胚胎左右軸分化

8、，并且認(rèn)為這種改變是由于乙醇干擾了Nodal信號(hào)通路導(dǎo)致的。為了證明這一假設(shè)，將外源性Noda1信號(hào)分子注射入斑馬魚胚胎，誘導(dǎo)其下游基因gsc和nt1的表達(dá)。通過檢測(cè)乙醇暴露后gsc和nt1的表達(dá)水平變化，證明了乙醇作用于Nodal信號(hào)通路干擾斑馬魚胚胎的發(fā)育。文獻(xiàn)報(bào)道，乙醇處理胚胎能夠使其．shh基因表達(dá)下調(diào)，但究竟乙醇是否直接干擾shh信號(hào)通路目前還沒有定論。我們將外源性的shh信號(hào)分子注射入斑馬魚胚胎，誘導(dǎo)其下游基因foxA2和n

9、kx2．2a的表達(dá)。通過檢測(cè)乙醇暴露后foxA2和nkx2．2a的表達(dá)水平變化，證明了乙醇對(duì)shh信號(hào)通路沒有直接的干擾作用。 Nodal的長(zhǎng)程效應(yīng)對(duì)維持胚胎內(nèi)Nodal濃度梯度起著重要的作用，sqt主要參與Nodal長(zhǎng)程旁分泌，而crc則參與Nodal短程旁分泌。我們發(fā)現(xiàn)乙醇對(duì)不同Nodal信號(hào)分子的干擾作用是不同的，將sqt和cycmRNA注射入128細(xì)胞期胚胎動(dòng)物極的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)，然后用乙醇處理，結(jié)果表明乙醇主要干擾了sqt