RKB-Akt在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中的功能研究與分析.pdf

1、蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB)也被稱為Akt，是一種絲/蘇氨酸激酶。它參與調(diào)節(jié)新陳代謝、細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活以及細(xì)胞分化等重要的細(xì)胞生理活動。而且，PKB/Akt是IGF1重要的下游分子之一，預(yù)示著它在生長發(fā)育和胰島素功能的調(diào)節(jié)中扮演著關(guān)鍵角色。在哺乳動物中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了PKB家族的三個成員，PKBα/Akt1，PKBβ/Akt2，PKBγ/Akt3。它們分別由不同的基因編碼，但結(jié)構(gòu)卻十分保守。但據(jù)已有的研究結(jié)果分析

2、，三者在活體內(nèi)的功能有互補(bǔ)也有差異：Akt1刪除導(dǎo)致小鼠新生死亡或者整體縮??；Akt2缺失會引發(fā)糖尿病；Akt3與出生后腦部尺寸有關(guān)。并且在敲除其中一種時，其余兩者的表達(dá)水平未見明顯升高，補(bǔ)償作用也不明顯，說明其功能具特異性。雖然PKB/Akt的研究已經(jīng)十分廣泛和深入，但是對該家族在早期胚胎發(fā)育中的功能還不明確。而且，小鼠的宮內(nèi)發(fā)育模式，不便于早期發(fā)育的觀察。所以我們利用斑馬魚胚胎體外發(fā)育、早期透明及便于基因操作等優(yōu)勢，圍繞著PKB對早

3、期胚胎發(fā)育的影響進(jìn)行研究和分析。
　　 PKBα/Akt1是生物體內(nèi)分布最廣泛，也是研究得最多的PKB成員。目前在斑馬魚中，只克隆得到了akt2與akt2like，其功能及其他成員的研究尚未見報道。所以我們合成了持續(xù)激活的小鼠myr-Akt1 mRNA并注射到斑馬魚胚胎內(nèi)過表達(dá)，觀察并分析了akt1在早期發(fā)育過程中的作用。過表達(dá)后的表型分析顯示，小鼠Akt1對早期胚胎的影響主要集中在腦部，表現(xiàn)為相對腦厚度和相對腦長度的顯著增加，

4、胚胎其他表型相對正常。用PI3K抑制劑LY294002抑制Akt激活后，可見腦部尺寸恢復(fù)到與對照組無差異的水平。在進(jìn)一步分析了細(xì)胞增殖、細(xì)胞命運(yùn)決定和細(xì)胞凋亡后發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)myr-Akt1對細(xì)胞增殖沒有影響，對細(xì)胞命運(yùn)決定也沒有影響，只是顯著減少了腦部的自發(fā)性細(xì)胞凋亡，這可能是其增大腦部尺寸的方式之一。并且，我們還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)myr-Akt1在活體內(nèi)對熱激處理和UV照射處理引發(fā)的神經(jīng)元凋亡具有抵抗作用，具有神經(jīng)保護(hù)作用。這些結(jié)果是Akt

5、1對早期胚胎發(fā)育影響的直接證據(jù)。并且說明PKBα/Akt1不僅對生物的整體生長發(fā)育調(diào)控有關(guān)，也對腦部的發(fā)育和大小有特異的影響。
　　 隨后.我們采用RT-PCR和RACE相結(jié)合的方法，克隆得到了斑馬魚的pkby/akt3基因。其cDNA全長2874bp，編碼479個氨基酸。斑馬魚Akt3具有Akt家族成員間保守的PH結(jié)構(gòu)域、催化活性結(jié)構(gòu)域和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域以及兩個保守的磷酸化位點(diǎn)Thr308和Ser473。與已發(fā)表的人、大鼠、小鼠等物

6、種的Akt3氨基酸序列比較，相似性分別為95.8％、94.7％和95.4％。RT-PCR檢測早期斑馬魚胚胎中akt3分布，發(fā)現(xiàn)在0-4hpf表達(dá)量較高，6-12hpf降低至較低水平，16hpf后表達(dá)量開始逐漸上升，至60hpf-96hpf則穩(wěn)定在較高水平。原位雜交結(jié)果表明，akt3在2hpf至96hpf的胚胎都有表達(dá)，且沒有組織特異性。在成魚中，除鰓部外，Akt3在所檢測的其余組織器官均有表達(dá)，在腦部和卵巢表達(dá)量較高；與Akt1研究相似

7、的，我們構(gòu)建并合成了斑馬魚myr-akt3 mRNA。過表達(dá)的結(jié)果顯示，akt3能使斑馬魚胚胎的發(fā)育滯后且伴隨著尾部短粗、體節(jié)模糊、尾末端膨大甚至嚴(yán)重縮短等不同程度畸形。而在斑馬魚myr-akt3注射組發(fā)育至24hpf時觀察，排除akt3造成的發(fā)育延遲后，發(fā)現(xiàn)注射過akt3的斑馬魚胚胎的腦部厚度和長度較對照組顯著增大，表明akt3對斑馬魚胚胎腦部尺寸發(fā)育有影響。
　　 綜上所述，PKBα/Akt1，PKBγ/Akt3在斑馬魚早期