家蠶BmOVO對卵巢腫瘤基因(otu)啟動子活性的調(diào)控機制.pdf

1、家蠶BmOVO是一種轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)卵巢發(fā)育中發(fā)揮作用。為了探討B(tài)mOVO四種剪接亞型的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性及其不同的結(jié)構(gòu)域?qū)D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的影響，以pFastBacTMDual為基礎(chǔ)載體構(gòu)建了4個熒光素酶 luc基因表達載體pFast-potu-Luc-ie1-ovo，其中，Bmovo基因的4種剪接亞型(Bmovo-1，2，3，4)分別由家蠶桿狀病毒的ie-1啟動子控制、熒光素酶luc基因由家蠶卵巢腫瘤otu基因啟動子控制。將熒光素酶luc基因

2、表達質(zhì)粒和內(nèi)參pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染家蠶BmN培養(yǎng)細胞，通過雙熒光素酶活性檢測研究BmOVO對otu基因啟動子活性的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，BmOVO-2、BmOVO-3和BmOVO-4對otu啟動子活性有正調(diào)節(jié)作用，其中BmOVO-2轉(zhuǎn)錄激活的活性最高；而轉(zhuǎn)染低劑量的pFast-potu-Luc-ie1-ovo1時，對otu啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用不明顯，但隨著轉(zhuǎn)染劑量的增加有增強otu啟動子活性的趨勢。
　　另外，本研究還通過不同組合

3、的雙熒光素酶基因表達載體共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細胞研究其對otu啟動子活性的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)pFast-potu-Luc-ie1-ovo1分別與pFast-potu-Luc-ie1-ovo2、pFast-potu-Luc-ie1-ovo3、pFast-potu-Luc-ie1-ovo4共轉(zhuǎn)染細胞后，與單獨轉(zhuǎn)染pFast-potu-Luc-ie1-ovo對照區(qū)相比，otu啟動子的轉(zhuǎn)錄活性被顯著提高，表明BmOVO-1可能與BmOVO-2、BmOVO-3

4、、BmOVO-4等相互作用提高otu啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。
　　BmOVO的C-末端有C2H2鋅指基序，N-末端結(jié)構(gòu)域不同亞型間存在差異，為了探討B(tài)mOVO N端各結(jié)構(gòu)域的功能，在對BmOVO-1蛋白序列進行結(jié)構(gòu)域分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)結(jié)構(gòu)域特點對Bmovo-1基因進行了截短，并構(gòu)建含不同截短Bmovo-1序列表達盒的熒光素酶基因表達載體。通過轉(zhuǎn)染細胞后熒光素酶活性分析，發(fā)現(xiàn)BmOVO-1蛋白的N端第1、3個酸性結(jié)構(gòu)域(A1，13-25a

5、a；A3，180-191aa)起轉(zhuǎn)錄抑制作用，第2個酸性結(jié)構(gòu)域(A2，30-51aa)、第1個堿性結(jié)構(gòu)域(B1，253-311aa)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用不明顯，第4、5個酸性結(jié)構(gòu)域(A4，339-352；A5，362-372)可能起轉(zhuǎn)錄激活作用；將結(jié)構(gòu)域A1與轉(zhuǎn)錄激活因子BmOVO-2的N端融合，發(fā)現(xiàn)融合后的重組BmOVO-2的轉(zhuǎn)錄激活作用急劇下降，進一步說明A1有抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄作用。
　　另外，Bmovo是否能通過其他基因互作調(diào)節(jié)靶

6、基因表達仍不明了。以往的研究顯示，果蠅編碼的小分子多肽Tal對Shavenbaby的功能有調(diào)控作用，家蠶中是否存在與果蠅中相類似的調(diào)節(jié)方式？家蠶tal-like基因的轉(zhuǎn)錄本中具有4個編碼tal-like的讀碼框(A1-A4區(qū))和1個編碼33aa的B區(qū)。在本研究中，將tal-like基因全長cDNA序列(tal)、帶有5’非編碼序列的具有A1-A4區(qū)和B區(qū)的cDNA序列(5A1-4+B)、具有A1-A4區(qū)和B區(qū)的cDNA序列(A1-4+B

7、)以及含有B區(qū)及其下游序列(B)分別克隆進昆蟲細胞表達載體pIZT-V5/His分別構(gòu)建tal-like基因表達載體pIZT/V5-His-tal、pIZT/V5-His-5A1-4+B、pIZT/V5-His-A1-4+B、pIZT/V5-His-B，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細胞，雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染上述質(zhì)粒的細胞中的otu啟動子的活性明顯降低，提示家蠶Tal-like小肽可下調(diào)otu啟動子的活性；tal-like基因表達載體與p

8、Fast-potu2-2-Luc-ie1-ovo1的共轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果顯示，Tal-like小肽(tal、5A1-4+B和A1-4+B)下調(diào)的otu啟動子的活性能被BmOVO-1挽救；將BmOVO-1蛋白的N端(28aa)和紅色熒光蛋白(DsRed)融合表達質(zhì)粒pIZT/V5-His-ovodsRED與tal-like基因表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細胞，通過細胞熒光觀察和western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，Tal-like小肽(5A1-4+B

9、和A1-4+B)能激發(fā)BmOVO-1的N端的水解。另外，通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測還發(fā)現(xiàn)TGF-β家族成員Dpp和daw、Wnt信號通路的調(diào)控因子酪氨酸激酶樣的孤獨受體（Ror2）、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）和類胰島素基因BBX-B8對BmOVO-2轉(zhuǎn)錄激活有拮抗作用。這些結(jié)果為我們理解BmOVO對靶基因表達的精細調(diào)控提供了線索。
　　為鑒定BmOVO蛋白在otu基因啟動子上的結(jié)合位點，根據(jù)果蠅OVO靶位點的保守序列（TT

10、ACMGTTACA，M=A/C），利用JASPAR CORE（http://jaspar.genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.pl）分析預(yù)測了otu啟動子序列(BABH01009636)中的BmOVO的可能結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)有3個候選結(jié)合位點，序列分別為：GTACCGTTGTA(CE1，20496-20506區(qū)域)、AGGCCGTTAAG(CE2，20598-20608區(qū)域)、CCTGAACTACA(CE3，2072

11、8-20738區(qū)域)。凝膠阻滯實驗（EMSA）結(jié)果顯示，BmOVO-2 C端的重組蛋白(400-577 aa)與otu啟動子上的CE1位點結(jié)合能力最強，證明BmOVO能直接結(jié)合到otu基因啟動子上從而調(diào)控otu基因的表達。另外，我們還發(fā)現(xiàn)otu啟動子還能與細胞核內(nèi)的其他蛋白結(jié)合，將CE1中的第2位堿基T突變成C(T2->C)，其與核蛋白的結(jié)合能力減弱，而將第11位堿基A突變成G(A11->G)，其與核蛋白的結(jié)合能力增強。不同截短的otu

12、啟動子控制熒光素酶基因的報告系統(tǒng)檢測顯示，CE1、CE2缺失對BmOVO-1調(diào)節(jié)otu啟動子活性的影響不明顯；當(dāng)CE1缺失時，BmOVO-2介導(dǎo)調(diào)節(jié)的otu啟動子活性驟減，但同時CE1和CE2缺失時，對BmOVO-2介導(dǎo)調(diào)節(jié)的otu啟動子活性影響不明顯；當(dāng)缺失CE2時，BmOVO-3介導(dǎo)調(diào)節(jié)的otu啟動子活性下降，但缺失CE1時，對BmOVO-3介導(dǎo)調(diào)節(jié)的otu啟動子活性影響不明顯。表明otu基因啟動子活性不僅受到其具有的順式調(diào)控元件的

13、影響，還受到轉(zhuǎn)錄因子BmOVO和其他反式作用因子的調(diào)控。CE1位點不同突變/缺失的otu啟動子控制熒光素酶基因的報告系統(tǒng)檢測顯示，當(dāng)T2->G或C時，BmOVO-2介導(dǎo)調(diào)節(jié)的otu啟動子活性增強，由T2->A時，對otu啟動子活性無明顯影響；當(dāng)A3-> T、G或C時，otu啟動子活性減弱；當(dāng)?shù)贏11->T或C時，otu啟動子活性下降，當(dāng)A11->G時，otu啟動子活性升高；當(dāng)分別缺失T2、A3和A11時，otu啟動子活性基本沒有變化，但